Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Yenehiwot Berhanu Weldearegay

In vivo and in vitro characterization of Mycoplasma mycoides subspecies mycoides by transcriptomic and proteomic analysis

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107761

title (ger.)

In vivo und in vitro Charakterisierung von Mycoplasma mycoides subspecies mycoides durch Transkriptom und Proteomanalyse

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/weldearegayy_ws15.pdf

abstract (deutsch)

In der vorliegenden Studie wurden Transcriptom- und Proteom-Analysen von Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (Mmm) mit in vivo, in vitro und ex vivo. gewonnenen Proben durchgeführt. Bei dem in vivo Material handelt es sich um Pleuralergüsse (PE) von Rindern, die experimentell mit Mmm infiziert wurden. Diese Proben lieferten neben den Mmm Daten zum ersten Mal auch eine Charakterisierung des Proteoms der Pleuralflüssigkeit von Rindern. Als ex vivo System wurde Mmm in nicht-inaktiviertem Rinderserum kultiviert. Dieses Medium soll die in vivo Bedingungen (PE) nachstellen. Für die in vitro Untersuchungen wurde Mmm in Standard-Medium kultiviert. Proben aus der frühen exponentielle und der frühen stationären Wachstumsphase wurden für die Transcriptom- und Proteom-Analysen verwendet.

Die PE-Proben von experimentell infizierten Rindern enthielten eine beträchtliche Anzahl lebens- und vermehrungsfähiger Mmm Zellen. Dieses Material stellt offensichtlich eine “in vivo Niche“ für die Vermehrung des Erregers im natürlichen Wirt dar. Bei der Untersuchung des PE-Proteoms wurden 315 Mmm Proteine identifiziert. Durch bioinformatische Analyse dieser Proteine konnten deren vermutete zelluläre Lokalisierungen und Funktion charakterisiert werden. Translation, ribosomale Struktur und Biogenese sowie Kohlenhydratstoffwechsel waren die häufigsten Funktionen der identifizierten Mmm Proteine. Außerdem wurden Mmm Proteine, die vermutlich an der Kapselsynthese beteiligt sind, wie z.B. ManB, Glf und Glycosyltransferasen, nachgewiesen. Auch Virulenz-assoziierte Proteine wie LppQ und die am Glycerin-Metabolismus und der Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies beteiligten Proteine GtsA, GlpF GlpK und GlpO wurden identifiziert.

Bei den Rinderproteinen, die in den PE-Proben identifiziert wurden, handelt es sich hauptsächlich um Plasmaproteine sowie Proteine des angeborenen Immunsystems, z.B. Komplement-Komponenten, CD-Marker und Proteine der Thrombozyten-Aktivierung und -Degranulierung. Akut-Phase-Proteine (APP), wie beispielsweise Serum-Amyloid-A, Haptoglobin und Fibrinogen-β wurden ebenfalls detektiert. Außerdem wurden das SPARC-Protein (‚Secreted protein acidic and rich in cysteine‘) und Thrombospondin-Proteine identifiziert, die eine Fibrose anzeigen. Insgesamt bestätigten die identifizierten Proteine die Pathophysiologie der Rinder-Lungenseuche.

Die Transcriptom-Analysen von Mmm wurden mit Proben aus der frühen exponentiellen und stationären Wachstumsphase von Kulturen in Standard-Medium mit Strang-spezifischer RNA-Sequenzierung durchgeführt. Hierbei wurde die Expression von 90% der annotierten Mmm Gene nachgewiesen, wobei 34 Gene eine signifikant differentielle Expression (2-fache Auf-/Ab-Regulation) zwischen den beiden Probenahmezeiten zeigten. Die weitere Charakterisierung des Transkriptoms mit Hilfe des Programms “Rockhopper“ erlaubte die Bestimmung von Multigen-Operons (227), 5'-UTRs (354), 3'-UTR (238), Transkriptionsstartstellen (664) und nicht-kodierenden RNAs (58) im hier verwendeten Mmm Stamm Gladysdale. Die Proteomanalyse wurde mit Proben der gleichen Kultur-Zeitpunkte durchgeführt. Hierbei wurden 53% der theoretischen Proteine nachgewiesen. Insgesamt können diese Daten zur Verbesserung der Genom-Annotation verwendet werden.

Versuche zur Etablierung eines ex vivo Kultursystems, das die in vivo Bedingungen in der Pleuralflüssigkeit imitiert, wurden mit nicht-inaktiviertem Rinderserum durchgeführt. Obwohl beschrieben ist, dass nicht-inaktiviertes Rinderserum das Wachstum der Mycoplasmen hemmt, konnte durch schrittweise Erhöhung der Serumkonzentration eine Anpassung von Mmm erreicht werden, sodass die Bakterien auch in nicht-inaktiviertem Rinderserum wachsen. Ein Vergleich von Serum-adaptierten und in Standard-Medium gezüchteten Mmm Zellen im Western-Blot mit Rekonvaleszenten-Serum zeigte zusätzliche immunogene Proteine in den Serum-adaptierten Proben. Bei der Untersuchung ausgewählter Protein-Banden der Serum-adaptierten Proben wurden verschiedene Rinderprotein, insbesondere Komplement-Komponenten sowie Mmm Proteine, z.B. ABC-Transporter, Substrat-Bindeproteine und Phosphotransferase-Proteine identifiziert. In weiterführenden Untersuchungen können Transcriptom- und quantitative Proteom-Untersuchungen zu einem besseren Verständnis der Anpassung und des Überlebens von Mmm in nicht-inaktiviertem Rinderserum bzw. im Wirt führen.

Abschließend kann man zusammenfassen dass, (i) Mmm Virulenz-assoziierte Proteine und Proteine der Immunevasion in vivo und unter in vivo imitiertenden Bedingungen produziert, (ii) PE-Proben von Rindern mit CBPP hauptsächlich Plasmaproteine, Akut-Phase Proteine und Proteine des angeborenen Immunsystems enthalten, (iii) während des in vitro Wachstums die Mehrheit der Gene transkribiert und  translatiert werden, wobei einige Gene eine differentielle Expression in den verschiedenen Wachstumsphasen zeigen. Daraus ergibt sich eine Basisinformation für künftige Vergleichsstudien mit in vivo Proben oder Mmm Proben, die unter Stressbedingungen gewachsen sind, (iv) Mmm kann an das Wachstum in nicht-inaktiviertem Rinderserum angepasst werden, womit ein en vivo Modell für die bessere Untersuchung von Virulenzfaktoren und möglichen Kandidaten für Impfstoffe und Diagnostika zur Verfügung steht.

 

abstract (englisch)

The current study focused on transcriptomic and proteomic analysis of Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (Mmm) in vivo, in vitro and ex vivo. For in vivo study, pleural effusion (PE) from cattle experimentally infected with Mmm was used for proteomic characterization of in vivo adapted Mmm. For ex vivo study, a system of growing Mmm in non-inactivated bovine serum was established and tested as a method of implementing 3R sytem (Replace, Reduce or Refine animal tests) for studying about Mmm. For the in vitro study, Mmm grown in an artificial media with standard growth conditions at early logarithmic and stationary growth phases was used to do transcriptomic and proteomic analysis. Furthermore, proteomic profile of bovine PE from cattle experimentally infected with Mmm was conducted for the first time.

Pleural effusion from cattle with experimental infection of Mmm revealed considerable number of viable Mmm cells, which are able to replicate in PE, which allowed us to rename the PE as a suitable ‘in vivo niche’ of Mmm. The proteomic investigation of PE from these experimentally infected cattle revealed Mmm and bovine proteins. A total of 315 putative predicted Mmm proteins were detected. Bioinformatic analysis of these proteins revealed their predicted localizations and function. Translation, ribosomal structure and biogenesis were the main functions of the identified Mmm proteins followed by carbohydrate metabolism. Mmm proteins, which are involved in capsule synthesis such as ManB, Glf and Glycosyltransferases were detected. Moreover, previously identified virulence associated proteins such as LppQ, (involved in inflammation), GtsA, GlpF, GlpK and GlpO (involved in glycerol transport and metabolism followed by release of reactive oxygen species) were detected, indirectly proving the disease pathology.

Bovine proteins detected from the PE were mainly plasma proteins with an enrichment of proteins of the innate immune system such as complement components, CD markers, proteins indicative of platelet activation and degranulation. Acute phase proteins (APPs) such as serum amyloid-A, haptoglobin and fibrinogen beta chain were highly abundant in PE. This supports the pathophysiology of the disease. The other finding of bovine proteins in this study is the detection of SPARC (Secreted protein acidic and rich in cysteine) and thrombospondin proteins, which indicate fibrosis.

Transcriptomic analysis of Mmm in the early logarithmic and stationary growth phases were conducted in vitro in standard medium using strand specific deep RNA sequencing. The result revealed expression of 90 % of the total annotated Mmm genes during these two growth phases, and of these, a total of 34 genes were significantly differentially expressed (q-value < 0.01) with a fold change of ± 2. Basic information about the pathogen’s molecular characteristic was identified including determination of multigene operons (227), 5’-UTRs (354), 3’-UTRs (238), transcriptional start sites (664) and non-coding RNAs (58) in Mmm strain Gladysdale. Proteomic analysis of samples from the same time points revealed the translation of 53 % of the putative predicted proteins. The use of these transcriptomic and proteomic data for proteogenomic study is recommended so as to reveal non-annotated novel protein coding genes and improvement of genome annotation.

Preliminary investigation dealing with the establishment of ex vivo growth conditions, which mimics in vivo situation using non-inactivated bovine serum, was performed. Non-inactivated bovine serum was reported to inhibit the growth of mycoplasma. Using a step-wise adaptation process, Mmm were able to grow in non-inactivated bovine serum. Immunologic investigation of Mmm grown in non inactivated serum revealed detection of more antigens using sera from infected cattle as compared to Mmm grown in standard media. Additionally, proteomic analysis on selected protein bands of Mmm grown in non-inactivated serum revealed bovine and Mmm proteins, where complement components were the major bovine proteins and ABC transporter and substrate-binding protein and phosphotransferase system EIIC were major Mmm proteins detected. Further investigation dealing with quantitative proteomic and transcriptomic analysis remains to be a priority for better understanding of Mmm survival in non-inactivated bovine serum.

In conclusion, (i) Mmm produces virulence associated and immune evasion proteins in vivo and in environments mimicking in vivo, (ii) bovine PE from cattle with CBPP is composed of plasma proteins with abundant APPs and proteins of the innate immune system, (iii) during in vitro growth majority of genes are transcribed and proteins translated with minimal differential expression in different growth phases, which gives a baseline information for future comparative studies using in vivo samples or for the pathogen grown under stress conditions, (iv) Mmm can be adapted to grow in non-inactivated bovine serum and this can be used as a 3R model for better investigation of virulence studies so as to be able to identify potential candidates for vaccines, diagnostics or therapeutic targets.

keywords

Mykoplasmen, Lungenseuche, Pleuralerguss; Mycoplasma, CBPP, Pleural effusion

kb

3.134