Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Yimin Wang

Characterization of canine dorsal root ganglion neurons and growth promoting effects of GM1-gangliosides

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106083

title (ger.)

Charakterisierung kanine Neurone aus Dorsalwurzelganglion und wachstumsfördernde Effect von GM1-Gangliosiden

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/wangy_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Neuronenkulturen aus Dorsalwurzelganglien von Maus und Ratte wurden in zahlreichen Gebieten der neurowissenschaftlichen Forschung als Modell verwendet, um molekulare Mechanismen der neurogenen Schmerzentstehung sowie die Ausbreitung verschiedener Viren und Prione zu charakterisieren. Mensch und Hund weisen im Hinblick auf Struktur und Organisation des zentralen und peripheren Nervensystems viele Parallelen auf. Zudem wurde in verschiedenen Studien gezeigt, dass insbesondere kanine Gliazellen mehr korrespondierende Eigenschaften zu humanen Gliazellen besitzen als aus Nagern isolierte gliale Zellen. Aufgrund spezies-spezifischer Stoffwechselwege, wie zum Beispiel der Degradation des GM1-Gangliosids (GM1), ist die Übertragbarkeit von Ergebnisse aus Studien an Nagern auf den Mensch limitiert. Die multiplen Einflüsse von GM1 auf das zentrale und periphere Nervensystem wurden unter Verwendung verschiedener Zellkultursysteme untersucht. Im Rahmen korrespondierender in vivo Studien wurde gezeigt, dass Alters-assoziierte Veränderungen des GM1-, nerve growth factor (NGF)- und/ oder fibroblast growth factor (FGF) 2- Metabolismus als modulierender oder sogar verursachender Faktor der Alzheimer- und Parkinson Erkrankung anzusehen sind. GM1 wurde, wenn auch nur bedingt, zur Therapie dieser mit Synapsen-Verlusten einhergehenden, neurodegenerativen Krankheiten eingesetzt. Die molekularen Mechanismen, die die erfolgreiche Applikation von GM1 erklären, sind bisher allerdings nur partiell erforscht. Aus diesem Grund stellt der Hund möglicherweise ein alternatives Modell zu Studien an Nagern dar, anhand dessen bisher nicht bekannte Effekte von GM1 untersucht werden können.

Es war daher Ziel dieser Studie, die in vitro und in vivo Expression von verschiedenen Struktur- und Funktionsproteinen in Neuronen und nicht-neuronalen Zellen des Dorsalwurzelganglions adulter Hunde mittels Licht- und Transmissionselektronenmikroskopie, Immunhistologie und Immunfluoreszenz zu charakterisieren. Darüber hinaus wurde untersucht, inwieweit die neurotrophen Faktoren GM1, NGF und FGF 2 dieses Expressionsmuster in vitro beeinflussen.

Zahlreiche kanine, gliale Satellitenzellen wiesen eine Ko-Expression von CNPase, GFAP und Vimentin auf. Glutaminsynthetase wurde im Gegensatz zu Maus und Ratte lediglich in wenigen Zellen nachgewiesen. Darüber hinaus zeigten über 80% dieser glialen Zellen eine Expression von Sox2, was als Hinweis auf mögliche Stammzelleigenschaften zu interpretieren ist. Zudem verstärkten diese Zellen in Ko-Kultur mit Neuronen aus dem Dorsalwurzelganglion das Neuritenwachstum. Aufgrund dieser Beobachtungen ist anzunehmen, dass gliale Satellitenzellen möglicherweise eine bisher nicht näher untersuchte Zellpopulation mit Stammzelleigenschaften darstellen.

Unter Einfluss der neurotrophen Faktoren GM1, NGF und FGF2 stellte sich in nicht neuronalen Zellen in vitro eine Änderung des Expressionsmusters sowie der Zellmorphologie dar. Zellen, die in GM1 supplementiertem Medium kultiviert wurden, zeigten eine gesteigerte Vimentin- und Glutaminsynthetase-Expression, während kein Einfluss auf die Anzahl S100, growth associated protein (GAP)-43 oder Sox2 positiver Zellen festgestellt wurde. Zudem führte der Zusatz von GM1 und FGF2 zu einer multipolaren Morphologie Vimentin exprimierender Zellen und signifikanter Reduktion der Anzahl GFAP positiver Zellen. Aufgrund dieser Ergebnisse ist anzunehmen, dass GM1 die Differenzierung jedoch nicht einen möglichen Vorläuferstatus nicht-neuronaler Zellen des Dorsalwurzelganglions beeinflusst. Zudem scheint FGF2 eine astrozytäre Differenzierung zu begünstigen, welche durch GM1 inhibiert wird. Dementsprechend ist GM1 als Faktor zu betrachten, der möglicherweise die Bildung von Glianarben, die bei verschiedenen Erkrankungen des ZNS beobachtet werden, hemmen kann. Des Weiteren kann GM1 möglicherweise den extrazellulären Gehalt von Glutamat und damit dessen konsekutive Neurotoxizität reduzieren, welches einen Mechanismus darstellt, der die positiven therapeutischen Effekte, die durch eine GM1 basierte Therapie bei Alzheimer und Parkinson Patienten erzielt wurden, erklären kann. Zudem wurde durch die GM1-Applikation ein direkter neurotropher Effekt beobachtet, welcher sich in der Ausbildung eines neuronalen Netzwerkes sowie der Expression verschiedener Proteine des Zytoskeletts manifestierte. Insbesondere wurde in Neuronen, die mit GM1 insbesondere in Verbindung mit NGF kultiviert wurden, Neuriten-assoziierte Akkumulationen von Synaptophysin festgestellt. Zudem war bei dieser Kulturbedingung eine erhöhte Anzahl an Neuriten nachweisbar, welche eine Expression von neuronal class III ß tubulin, GAP-43 sowie phosphoryliertemund nichtphosphoryliertem Neurofilament zeigten. Diese Beobachtung weist möglicherweise auf eine direkte, GM1 modulierte Bildung neuer Synapsen hin. Außerdem ist ein sekundärer Effekt als Folge gesteigerter, neuronaler Arborisierung und korrespondierendem Anstieg der Fläche zur Ausbildung von Synapsen in Betracht zu ziehen. Des Weiteren ist nicht auszuschließen, dass die nachgewiesenen Synaptophysin-Akkumulationen als Korrelat eines erhöhten retro- bzw. anterograden Transportes synaptischer Vesikel anzusehen sind. Mittels Elektronenmikroskopie wurde nachgewiesen, dass Neurone, die unter Zusatz von GM1/NGF kultiviert wurden, mehr multivesikuläre Körper und Akkumulationen von Mitochondrien in Neuriten assoziierten Auftreibungen zeigten. Diese Beobachtungen können als Korrelat einer gesteigerten Internalisierung membrangebundener Rezeptoren und/oder einer Aufregulierung des autophagen Stoffwechsels interpretiert werden. Zudem ist zu vermuten, dass GM1 eine erhöhte Kapazität des Dynein vermittelten retrograden Transports geschädigter Mitochondrien zum weiteren Abbau induziert. Zusammenfassend wurden im Rahmen dieser Studie verschiedene Mechanismen aufgedeckt, die die positiven Effekte einer GM1 basierten Therapie der Alzheimer Erkrankung erklären.

Das Modell der Kultur von Neuronen aus Dorsalwurzelganglien adulter Hunde bietet potentiell vielfältige Möglichkeiten. Dennoch sind dessen molekulare und phänotypische Eigenschaften bisher weitgehend unbekannt. Die detaillierte immunhistochemische in vivo und in vitro Charakterisierung dieses Modells und dessen Modulation durch neurotrophe Faktoren wie GM1, NGF und FGF2 ist daher als Basis für potentielle Vergleiche zu Menschen und Nagern anzusehen. Zudem ermöglicht sie die Evaluierung dieses Modells im Hinblick auf seine Verwendbarkeit in weiteren human- und veterinärmedizinischen Studien. Kulturen adulter kaniner Neurone aus dem Dorsalwurzelganglion sind als ein valides in vitro Modell anzusehen, welches die Untersuchung der molekularen Pathogenese verschiedener, neurodegenerativer Erkrankungen ermöglicht.

abstract (englisch)

Cell cultures of rodent dorsal root ganglia (DRGs) have been extensively used in fundamental neuroscience, pain, virus, and prion protein research. The structure and organization of the canine and human central nervous system (CNS) and peripheral nervous system (PNS) is similar to a large extent and recent studies demonstrated that species-specific properties of human glia are closer related to dogs than rodents. Furthermore, differences in specific metabolic pathways between humans and rodents such as the degradation of GM1-ganglioside (GM1) may limit the extrapolation of rodent data to humans. GM1 mediated effects on the CNS and PNS were characterized in a multiplicity of cell culture systems. In addition, several in vivo studies revealed that age-associated alterations in GM1, nerve growth factor (NGF) and/or fibroblast growth factor (FGF) 2 metabolism are a modulating or even causative factor in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD) or Parkinson’s disease (PD). GM1 was also applied to treat, in part, these neurodegenerative diseases ongoing with synaptic loss. However mechanisms explaining GM1 therapeutically effects remained undetermined. Therefore, alternative models to rodents may reveal new aspects in GM1 related research.

The present in vivo and in vitro study investigated the expression of a variety of structural and functional proteins of adult canine DRG neurons and satellite glial cells (SGCs) cells by light microscopy, transmission electron microscopy, immunohistochemistry, and immunofluorescence. In addition, the influence of the neurotrophic factors GM1, NGF, and FGF2 on the expression pattern of these proteins was evaluated in vitro. Interestingly, the majority of canine SGCs showed a co-expression of CNPase, GFAP, and vimentin, whereas in contrast to rodents only a minority of cells was positive for glutamine synthetase. Furthermore, Sox2 expression in over 80% of these glial cells indicated that they exhibit characteristics of pluripotent stem cells. Canine SGCs also demonstrated a neurite promoting intrinsic capacity in co-culture with DRG neurons. Therefore, SGCs seem to represent a unique glial cell population with stem cell potency.

The neurotropic factors GM1, NGF, and FGF2 changed the expression pattern and morphology of DRG non-neuronal cells in vitro. The supplementation with GM1 increased the number of vimentin- and glutamine synthetase-positive non-neuronal cells, whereas no influence on S100, growth associated protein GAP-43 or Sox2 expression was observed. In addition, the supplementation with GM1 and FGF2 promoted a multipolar morphology of vimentin positive cells and significantly reduced GFAP expression compared to FGF2-cultivated cells. These findings indicate that GM1 might influence the differentiation but not a possible precursor state of non-neuronal DRG cells. In addition, FGF2 seems to favor astrocytic differentiation of glial cells, which might be inhibited by GM1. Therefore, GM1 might be used to decrease glial scar formation in different CNS disorders. GM1 might also reduce extracellular levels of neurotoxic glutamate revealing a mechanism to explain beneficial GM1 treatment effects in different neurodegenerative diseases including AD and PD. In neurons, GM1 exhibited direct trophic effects by influencing neuronal network formation and cytoskeletal protein expression. Interestingly, GM1 especially in combination with NGF, promotes accumulations of the synaptic marker synaptophysin in neuronal processes and increases the number of neurites, which were positive for neuronal class IIIß tubulin, GAP-43 as well as phosphorylated and non-phosphorylated neurofilament. Consequently, GM1 might directly promote the formation of new synapses. However, GM1 increased neuronal arborization causing an enlarged contact area for synapse formation. Furthermore, an increased retrograde transport of endocytosed synaptic vesicles or an enhanced anterograde transport can explain the presence of synaptophysin accumulations. Transmission electron microscopy demonstrated an increase in multivesicular bodies and mitochondria within neuronal bulbs of GM1/NGF grown neurons pointing to an enhanced membrane receptor internalization and/or autophagic clearance. In addition, GM1 might increase the dynein-mediated transport of damaged mitochondria to the neuronal soma for further degradation.

In summary, the present study revealed several mechanisms to explain beneficial therapeutic effects of GM1 in neurodegenerative diseases. Despite the potential wide application spectrum, the composition and phenotypical characteristics of cells cultured from adult canine dorsal root ganglia are largely unknown. Consequently, the present detailed description of canine DRGs from adult dogs in vivo and in vitro as well as the analysis of neurotrophic effects by NGF, FGF2, and GM1 were essential to demonstrate differences or parallels to rodents and humans, evaluate the usefulness of this canine model, and provide basic data for its future application in human and veterinary medicine. Moreover, the results of the current study support the use of adult canine DRGs as a valuable in vitro model to study the molecular pathogenesis of different neurodegenerative diseases.

keywords

Dorsal root ganglia, GM1-Gangliosides, Satellite glial cells, Drosalwurzelganglien, GM1-Gangliosids, Satelitenzellen

kb

19.563