Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Dorothee Walter

 

 

 An Alternative Model for Efficacy Testing of Exogenous Surfactant using the Isolated Perfused Rat Lung (IPL)

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108687

title (ger.)

Ein Alternatives Modell zur Effektivitätsbestimmung von Exogenem Surfactant in der Isoliert Perfundierten Rattenlunge (IPL)

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/walterdo_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Pulmonales Surfactant ist ein grenzflächenaktiver Komplex, der hauptsächlich von Typ-II-Pneumozyten produziert und recycelt wird. Dieses endogene Tensid besteht aus Lipiden (90 - 95%) und Proteinen (5 - 10%) und wird auf die Oberfläche der Alveolen sezerniert. Surfactant vermindert die Oberflächenspannung an der Alveolar-Kapillar-Membran. Ohne Lungen-Surfactant wäre ein Gasaustausch zwischen den Blutkapillaren und den Alveolen und somit eine normale Atemfunktion deutlich erschwert oder sogar unmöglich.

Bei Frühgeborenen kann die Lungenreifung und damit verbunden eine hinreichende Surfactantproduktion unzureichend sein. Surfactant-therapien mit exogenem Surfactant sind beim Atemnotsyndroms des Neugeborenen (engl.: respiratory distress syndrome, RDS) die Standardtherapie. Darüber hinaus wird die klinische Effektivität einer Surfactanttherapie zur Behandlung des akuten progressiven Lungenversagens (engl.: acute respiratory distress syndrome, ARDS) diskutiert.

Aus regulatorischer Sicht muss die Wirksamkeit von exogenen Surfactant-Chargen für die Behandlung von RDS und ARDS gewährleistet sein, bevor sie Patienten verabreicht wird. Hierfür werden Tiermodelle mit unreifer Lungenentwicklung oder sogenannte sekundäre Surfactant-Mangel-Tiermodelle eingesetzt. Beim häufig verwendeten Rattenlungen-Lavage (RLL)-Modell, wird ein sekundärer Surfactantmangel durch wiederholte bronchoalveoläre Lavagen (BAL) provoziert. Diese in vivo Studien an narkotisierten Tieren können zu ernsthaften Problemen wie respiratorische Azidose und vorzeitigem Versterben der Versuchstiere führen.

Das Ziel dieser Arbeit war es daher, ein ex vivo Modell für die Prüfung von exogenen Surfactant-Chargen zu etablieren. Die Analyse des Sauerstoffgehalts stellt hierbei den wichtigsten Parameter in der Effektivitätstestung dar. Aufgrund der Möglichkeit einer permanenten arteriellen Sauerstoffanalyse im Perfusat, könnte das Modell der isolierten, perfundierten Rattenlunge (IPL) hervorragend als Testmodell genutzt werden.

Die Experimente zeigten, dass IPLs mit einem mäßig verringerten Inspirations- zu Expirationsverhältnis von -15/-3,6 cmH2O für mindestens 240 min ohne Entwicklung eines Lungenödems beatmet werden können. Wurden IPLs mit medizinischem Sauerstoff beatmet, erreichten sie Sauerstoffgehalte über 400 mmHg, die damit ebenso hoch waren wie die im in vivo-Modell (RLL) gemessenen Sauerstoffwerte.

Die wiederholte Lavagierung der IPLs mit physiologischer NaCl-Lösung führte zu einer signifikanten Abnahme der dynamischen Lungencompliance und des Atemvolumens nach der 1. bzw. der 2. bronchoalveolären Lavage (BAL). Diese Beeinträchtigung der Lungenfunktion wurde durch eine Abnahme des pO2 unter 180 mmHg begleitet. Diese Reduktion entspricht einem moderaten ARDS-Niveau und kann mit den reduzierten Sauerstoffgehalten in RLL-Studien verglichen werden. Während der Durchführung bronchoalveolärer Lavagen wurde ein Anstieg des Lungengewichts verzeichnet, welcher bis Versuchsende stabil blieb und daher nicht auf eine Lungenödembildung schließen lässt. BALs führten in IPLs zu keiner erhöhten Zytotoxizität, während eine signifikant höhere Zytotoxizität in RLL-Versuchen in der Lavagenflüssigkeit der 5. BAL und am Versuchsende festgestellt wurde. Im Gegensatz hierzu zeigte sich ein erhöhtes TNF-α-Level am Ende der IPL-Studien während keine Induktion von TNF-α in Lavagenflüssigkeiten aus RLL-Experimenten gefunden wurde.

Die Verwendung eines Systems zur kontinuierlichen Pulver-Aerosolisierung (engl.: Continuous Powder Aerosolization, CPA) ermöglichte eine effektive Zuleitung von aerosolisiertem trockenen Surfactantpulver zu den IPLs. Die Zufuhr von exogenem Surfactant resultierte in einer verbesserten Lungenfunktion und einer vollständigen Regeneration der Anfangssauerstoffwerte, wodurch eine Wiederherstellung der Oxygenierung in der in vivo Situation widergespiegelt wird. Darüber hinaus konnte durch die Testung exogener Surfactantformulierungen mit reduziertem oder keinem Proteingehalt eine Abstufung in der Effektivität nachgewiesen werden. Hierbei weist die Surfactantformulierung mit dem höchsten Proteingehalt die höchste Effektivität auf. Zudem konnte gezeigt werden, dass aerosolisiertes rSP-C auch im IPL-Modell über eine Stunde lang effektiv wirkt.

Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, wie die Wirksamkeit von exogenen Surfactant-Chargen ex vivo getestet werden kann. Im Sinne des Tierschutzes kann die Verwendung von IPLs zu einer Verminderung und Verbesserung von Tierversuchen beitragen. Zudem ermöglicht die kontinuierliche Messung des Oxygenierungsstatuses eine genaue Bewertung der Effektivität der Lavagen und der exogenen Surfactant-Chargen.

 

abstract (englisch)

Pulmonary surfactant is a surface-active complex that is mainly produced and recycled by alveolar type II cells. Endogenous surfactant consists of lipids (90 - 95%) and proteins (5 - 10%) and is secreted to the alveolar surface. It increases the alveolar stability against collapse and improves uniformity of alveolar inflation by reducing the surface tension of the alveolar air-water interface. Without lung surfactant, gas exchange between blood capillaries and alveoli and thus, normal respiratory function would be considerably impeded or even impossible.

In premature infants, surfactant production can be insufficient due to impaired lung development. Surfactant replacement therapies with exogenous surfactant preparations has been shown to be an efficient treatment in neonates with respiratory distress syndrome (RDS). Moreover, the clinical efficacy of surfactant replacement therapies to treat acute respiratory distress syndrome (ARDS) is discussed.

In terms of regulatory aspects, efficacy of exogenous surfactant batches for the treatment of RDS and ARDS has to be ensured before surfactant administration to patients. Therefore, premature and secondary surfactant deficiency animal models were developed. A frequently used model to test surfactant efficacy is the rat lung lavage (RLL) model in which a secondary surfactant deficiency is provoked by performance of repetitive bronchoalveolar lavages. These studies on anesthetized animals can lead to serious problems like respiratory acidosis causing premature decease of test animals. Therefore, the aim of this thesis was to establish an ex vivo model for the testing of exogenous surfactant preparations. Analysis of oxygen levels is the most important parameter in surfactant efficacy testing. Isolated and perfused rat lungs (IPL) are an ideal test model as permanent arterial oxygen analysis in the perfusate is enabled.

The experiments showed that IPLs can be ventilated with a moderately decreased inspiratory to expiratory ratio ‑15/‑3.6 cmH2O for up to 240 min without development of pulmonary edema. Moreover, when ventilated with medical oxygen, IPLs reached oxygen levels 400 mmHg which are in the same range of in vivo trials in the RLL model.

The repetitive performance of an average of 6 saline bronchoalveolar lavages (BALs) in IPLs resulted in significant decreases in dynamic lung compliance and tidal volume after the 1st or the 2nd BAL, respectively. This impairment in lung function was accompanied by a decrease of pO2 < 180 mmHg which corresponds to a status of moderate ARDS and is alike the oxygen levels of lavaged lungs in RLL trials. During BAL performances, an increase in lung weight was noticed which remained stable until the end of IPL trials and therefore did not indicate edema formation. Saline lavages did not result in cytotoxicity in IPLs whereas a significant LDH concentration was found in the lavage fluid after the 5th lavage and at the end of RLL trials. In contrast to cytotoxicity findings, an indication of acute inflammation was found at the end of IPL trials whereas no TNF-α could be found in bronchoalveolar lavage fluids of RLL experiments.

The use of the Continuous Powder Aerosolization (CPA) System enabled the effective administration of aerosolized dry surfactant powder to IPLs. Exogenous surfactant resulted in an improvement of lung function and a complete regeneration of initial oxygen values which applies to the restoration of oxygenation in the in vivo situation. Moreover, a gradation in exogenous surfactant efficacies could be seen if preparations with reduced or no protein content were tested. The surfactant preparation with the highest protein content was the most effective one tested. In this study it could be shown that aerosolized rSP-C is effective for the restoration of oxygen saturation one hour after administration.

The results of this thesis indicate that the efficacy of exogenous surfactant batches can be tested ex vivo. In terms of animal welfare, the use of IPLs could contribute to reduction and refinement of animal trials. In this context, IPLs are not exposed to premature deceasing and the continuous measurement of the oxygenation status allows precise evaluation of efficacies of saline lavages and exogenous surfactant batches.

 

keywords

IPL, Surfactant, ex vivo

kb

2.414