Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Ulrike Wallner

Einfluss von Haltezeiten während der Frühphase der Konservierung auf den Energiemetabolismus und die Qualität von Eberspermien

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107740

title (engl.)

Effect of holding times during early stage of preservation on energy metabolism and quality of boar spermatozoa

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/wallneru_ws15.pdf

abstract (deutsch)

Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss von Haltezeiten zwischen 30 min und 6 h bei 21 °C sowie 32 °C während der Frühphase der Konservierung auf die Qualität gelagerten Eberspermas unter Anwendung gängiger Praxisverfahren zu untersuchen. Dabei wurden neben spermatologischen Parametern, wie der Motilität und Membranintegrität, mögliche Einflüsse auf den Energiestoffwechsel und das bakterielle Wachstum betrachtet. Zusätzlich sollten die praxisüblichen Verarbeitungsmethoden überprüft und Temperaturprofile während der Verarbeitungskette erhoben werden.

Es wurden sechs Experimente durchgeführt. Bei allen Experimenten wurden die Motilität der Spermien mittels CASA und der Anteil membranintakter Spermien mittels Durchflusszytometrie bestimmt. In Experiment 2 wurde zudem mit dem Fluoreszenzfarbstoff JC-1 durchflusszytometrisch das Mitochondrienmembran-potential ermittelt, sowie der Nukleotidgehalt (ATP, ADP, AMP) und die Energieladung der Samenzellen gemessen. Ein weiteres Augenmerk wurde darauf gelegt, den genauen Verlauf der Abkühlung jeder Verarbeitungsvariante im Labor zu dokumentieren.

Im ersten Experiment wurden zunächst die zweistufig isotherme Verdünnung mit der zweistufig hypothermen Verdünnung bei zwei Verdünnungsgraden, 10 x 10Spermien/ ml und 20 x 106 Spermien/ ml verglichen. Während der Lagerung bei 17 °C wiesen die isotherm verdünnten Proben eine bessere Qualität auf. Dies zeigte sich vor allem beim höheren Verdünnungsgrad.

In den Experimenten 2 bis 4 wurden daraufhin die Auswirkungen von Haltezeiten für 30 min, 60 min, 3 h und 6 h bei 32 °C und 21 °C bei verschiedenen Verarbeitungsbedingungen geprüft. Die Haltezeiten beeinträchtigten dabei die Spermienqualität, den Adenylat-Gehalt sowie das Mitochondrienmembranpotential nicht. Dies deutet darauf hin, dass Eberspermien über einen sehr effizienten Energiestoffwechsel verfügen. Das Keimwachstum wurde durch die Haltezeiten bis zu 60 min des 1:1 verdünnten Samens nicht negativ beeinflusst.

Im fünften Experiment wurden die Auswirkungen einer beschleunigten Abkühlrate des ausverdünnten Samens nach isothermer Verdünnung untersucht. Die schnelle Abkühlrate bei einer direkten Abkühlung bei 17 °C wirkte sich tendenziell negativ auf die Motilität aus. Allerdings wurden hier aufgrund des hohen spermatologischen Niveaus nur geringe Schwankungen der Werte ermittelt.

Im abschließenden Experiment wurde im ersten Schritt der Temperaturverlauf der Prozesskette der hypothermen Samenverarbeitung auf einer Besamungsstation mit dem Verlauf des isotherm durchgeführten Laborstandards verglichen. Die Samenportionen in der Besamungsstation kühlten aufgrund der höheren Temperatur der Verdünner und der Abkühlung in Bündeln von ca. 40 – 60 Tuben langsamer ab als die des Laborstandards. Im zweiten Schritt wurden die beiden Verarbeitungsverfahren im Hinblick auf die Spermienqualität verglichen, wobei die Motilität und Membranintegrität sich bei der langsamen Abkühlung der Besamungsstation als tendenziell besser erwiesen.

Die Temperaturmessungen der Verdünnungsverfahren ergaben bei dem Vergleich der zweistufig hypothermen mit der zweistufig isothermen Verdünnung, dass entgegen den Erwartungen durch den hypothermen Verdünner, eine schnellere Abkühlung auf die Lagerungstemperatur nicht erreicht wird. Bei beiden Methoden wurde diese nach der gleichen Zeitspanne erreicht.

Schlussfolgernd sind Haltezeiten bis zu 60 min bei 32 °C und 21 °C sowohl des 1:1 vorverdünnten als auch des ausverdünnten Samens vorteilhaft für die Samenqualität; verlängerte Haltezeiten führen nicht zum Energiedefizit der konservierten Spermien. Allerdings könnten Haltezeiten über 60 min je nach Keimbelastung und Bakterienart kritisch für den Keimgehalt während der Lagerung sein. Es konnte nachgewiesen werden, dass eine isotherme Verdünnung und ein langsames Abkühlen zu einer verbesserten Qualität der Besamungsportionen führt. Das derzeit in der Praxis noch häufig durchgeführte zweistufig isotherme Verfahren ist aus spermatologischer Sicht nicht empfehlenswert.

abstract (englisch)

The aim of the present study was to test the effect of holding times between 30 min and 6 h at 21 °C as well as 32 °C during the early stage of semen preservation on semen quality during storage. Spermatology parameters such as motility and membrane integrity as wells as possible influences on energy metabolism and bacterial growth were examined. Additionally, current routine procedures in artificial insemination (AI) laboratories were reviewed and temperature curves during semen processing were determined.

In total, six experiments were performed. In all experiments the sperm motility was determined by CASA and the proportion of membrane intact sperm was analyzed using flow cytometry. In the second experiment, additionally the mitochondrial membrane potential was determined by flow cytometry using the fluorescent dye JC‑1. Moreover, the content of nucleotides (ATP, ADP and AMP) and the energy charge of the sperm cells were measured. Special attention was paid to document the exact cooling curves for each variation of semen processing in all laboratory experiments.

In the first experiment the two-step isothermic dilution was compared with the two-step hypothermic dilution using two dilution rates, namely 10 x 10sperm/ ml and 20 x 106 sperm/ ml. As a result, isothermic diluted samples showed a higher semen quality during storage at 17 °C, especially at higher dilution level.

In Experiments 2 to 4 the effects of holding times for 30 min, 60 min, 3 h and 6 h at 32 °C and 21 °C were examined using different processing conditions.

Holding times neither had influence on semen quality nor on adenylate content and mitochondrial membrane potential. This suggests that boar sperm energy metabolism is very efficient. Bacterial growth was not negatively affected by holding times of the 1:1 pre-diluted semen up to 60 min.

In the fifth experiment, the effect of an accelerated cooling rate after isothermic dilution semen was studied. Rapid cooling rates to the storage temperature at17 °C tend to show adverse effects on motility. However, due to the high sperm quality level only minor variations between the experimental groups were found.

In the sixth experiment the temperature profile of hypothermically processed semen in an AI center was compared with the profile of the isothermically processed laboratory standard. Due to the higher temperature of the diluent and the packing of 40 to 60 semen tubes in bundles, semen doses in the AI-center cooled down slower than the single tube samples used in the laboratory standard. In the second step of this experiment, the two methods were compared in terms of semen quality. The results showed that semen processed with a slower cooling rate as in the AI-center tend to have better motility parameters and membrane integrity compared to the laboratory standard.

Contrary to expectations, the comparison of the temperature profiles of two-step isothermic and two-step hypothermic dilution showed that hypothermic diluted samples did not reach the final storage temperature earlier. Thus, in both dilution methods, the storage temperature of 17°C was reached after the same period of time.

In conclusion, holding times up to 60 min at 32 °C and 21 °C of prediluted semen and semen diluted to final concentration are beneficial for semen quality; prolonged holding times do not impair energy metabolism of stored semen. However, depending on germ load and the bacterial species, prolonged holding times up to 6 h may lead to moderately increased bacterial growth during storage. It is demonstrated that isothermic dilution and retarded cooling results in higher sperm quality. As a consequence, the in AI practice commonly used two-step isothermic method is no longer recommended.

keywords

Eberspermien, Haltezeiten, Energiemetabolismus, Boar sperm, holding times, energy metabolism 

kb

2.808