Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Lena Völlger

The role of the transcription factor HIF-1α in the formation of antimicrobial phagocyte extracellular traps

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106067

title (ger.)

Die Rolle des Transkriptionsfaktors HIF-1α bei der Bildung von antimikrobiellen “phagocyte extracellular traps”.

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/voellgerl_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Phagocyte extracellular trap (PET) ‑ Bildung wurde unlängst als ein neuartiger Mechanismus von Phagozyten zur Verteidigung gegen Infektionen beschrieben. Das Grundgerüst der PETs besteht aus DNA, die mit Histonen, Proteasen und antimikrobiellen Peptiden assoziiert ist. PETs ermöglichen das extrazelluläre Einfangen und Abtöten von mikrobiellen Erregern und wurden als erstes in neutrophilen Zellen entdeckt. Mittlerweile ist jedoch bekannt, dass neben Neutrophilen auch Mastzellen, Eosinophile und Makrophagen sowie Monozyten in der Lage sind PETs zu bilden. Mit der Zeit wird immer mehr über die zellulären Prozesse bekannt, die bei der PET‑Bildung eine wichtige Rolle spielen. Die regulatorischen Mechanismen hinter der PET‑Bildung sind jedoch noch kaum verstanden und ihre Entschlüsselung bedarf weiterer Forschung. Deshalb war das übergreifende Ziel dieser Arbeit, die Rolle des Transkriptionsfaktors Hypoxie-induzierter Faktor 1α (HIF-1α) in der Bildung von PETs zu untersuchen. Im Rahmen dieser Studie, wurden Neutrophile und Mastzellen als repräsentative, PET‑bildende Zellen ausgewählt. HIF-1α spielt bei der Regulation des Energiehaushaltes sowie der Anpassung an Bedingungen mit reduziertem Sauerstoffgehalt in Zellen eine wichtige Rolle. Zudem gibt es weitere Hinweise, dass HIF‑1α durch Kontakt mit mikrobiellen Erregern aktiviert wird und die bakterizide Wirkung von Phagozyten unterstützt. Die kurze Halbwertszeit und die gut verstandenen Mechanismen der post-translationalen Regulation von HIF‑1α machen den Transkriptionsfaktor zu einem attraktiven pharmakologischen Ansatzpunkt. HIF‑1α Agonisten werden gezielt entwickelt, um die bakterizide Wirkung von Immunzellen zu unterstützen und zusätzlich zu konventionellen Antibiotika, vor allem aber bei Infektionen mit arzneimittelresistenten Bakterien, eingesetzt zu werden.

Zuallererst, sollte die Rolle von HIF‑1α in der antimikrobiellen Wirkung von Mastzellen untersucht werden. Der neue Wirkstoff AKB-4924 wurde dabei zur pharmakologischen Inhibierung von Prolyl-Hydroxylasen eingesetzt, die im Abbauprozess von HIF‑1α eine wichtige Rolle spielen. Eine Steigerung der HIF‑1α Aktivität mittels AKB‑4924 führte zu einer erhöhten antimikrobiellen Wirkung in humanen sowie in murinen Mastzellen. Wichtig ist, dass dabei auch die Bildung von PET in Mastzellen (MCET) induziert wurde. Interessanterweise beeinflusste die Inhibition der Phagozytose mittels Cytochalasin D, auch in Gegenwart von AKB‑4924, die antimikrobielle Wirkung von humanen Mastzellen (HMC-1 Zellen) in keiner Weise. Dieses Ergebnis bestätigt, dass HIF‑1α eine extrazelluläre antimikrobielle Wirkung auslöst. Wird jedoch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) behindert, ist auch eine verringerte antimikrobielle Aktivität in HMC-1 Zellen zu beobachten. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass knochenmarksabstammende Mastzellen (BMMCs), isoliert aus HIF‑1α defizienten Mäusen, im Vergleich zu Kontroll-BMMCs, eine signifikant reduzierte antimikrobielle Wirkung gegen S. aureus aufweisen. Zudem konnten dieselben Zellen, als Antwort auf eine Stimulation mit AKB‑4924, keine MCETs ausbilden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Transkriptionsfaktor HIF‑1α eine wichtige regulatorische Rolle bei der extrazellulären antimikrobiellen Wirkung und der Bildung von PETs in Mastzellen spielt.

Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, ein Zellkulturmodell zu entwickeln, welches es ermöglicht, stellvertretend für primäre, blutabstammende Neutrophile, mit einer Zelllinie (ausdifferenzierte HL-60 Zellen) zu arbeiten. Nach der chemischen Differenzierung mit DMSO oder all-trans-Retinsäure (Vitamin-A-Säure), wiesen die HL‑60 Zellen jedoch eine mit primären Neutrophilen nicht identische antimikrobielle Wirkung auf. Die Ausbildung der für Neutrophile charakteristischen Eigenschaften ist somit nur unzureichend aufgetreten. Daher sind differenzierte HL‑60 Zellen nur von begrenztem Nutzen um primäre, blutabstammende Neutrophile in in vitro Experimenten zur antimikrobiellen Wirkung und PET‑Bildung zu untersuchen. Des Weiteren existieren zurzeit keine einheitlichen Protokolle, um PET‑Bildung in primären Neutrophilen zu analysieren. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit die am besten geeignete Zelldichte sowie Dauer der Induktion für die in vitro Experimente zur PET‑Bildung in primären, blutabstammenden Neutrophilen untersucht. Die besten Ergebnisse bei der Induzierung von PETs, als auch bei der PET‑Visualisierung wurden mit einer Zelldichte von 2x106 Zellen /ml und einer Induktionsdauer von 3 Stunden erzielt. Diese Bedingungen wurden dann für alle weiteren Experimente übernommen.

Das abschließende Ziel dieser Studie war es, die Rolle von eisenchelatbildenden HIF‑1α Agonisten bei der Bildung von PETs in Neutrophilen zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Eisenchelator Desferrioxamine (DFO) die Bildung von PETs in humanen sowie bovinen primären, blutabstammenden Neutrophilen fördert. Eine ergänzende Zugabe von Eisenionen verhindert jedoch die DFO induzierte PET‑Bildung. Weitere HIF‑1α Agonisten wiesen zudem einen identischen Effekt auf. Daher kann angenommen werden, dass HIF‑1α eine Schlüsselrolle in der PET‑Bildung spielt und z.B. PAD4, ROS, Elastase oder LL‑37 reguliert. Hinweise darauf konnten bereits experimentell gewonnen werden, indem die Funktion der entsprechenden Enzyme biochemisch inhibiert wurde.

Zusammenfassend zeigen die erzielten Ergebnisse, dass HIF‑1α eine wichtige Rolle bei der Bildung von PETs in Neutrophilen und Mastzellen spielen könnte. Mit diesem Wissen können Arzneistoffe entwickelt werden, welche die antimikrobielle Wirkung von Immunzellen gegen auftretende Infektionen unterstützen.

abstract (englisch)

Phagocyte extracellular trap (PET) formation has recently been described as a novel host innate immune defense of phagocytes. PETs consist of a DNA backbone with associated histones, proteases and antimicrobial peptides. Those PETs provide a matrix to entrap and kill microbes. They were discovered in neutrophils for the first time and named as neutrophil extracellular traps (NET). Nevertheless, besides neutrophils also mast cells, eosinophils and macrophages/monocytes are able to release extracellular traps. Knowledge is emerging regarding the cellular processes that precede the formation of PETs. However, the regulatory mechanisms which mediate PET formation are still rarely understood. Therefore, the overall aim of this study is to evaluate the role of the transcription factor hypoxia inducible factor 1α (HIF‑1α) in the formation of PETs. Neutrophils and mast cells were chosen as representative PET forming cells within this study. HIF-1α is a major regulator of energy homeostasis and cellular adaptation to low oxygen stress. Further, there is increasing evidence, that HIF‑1α is activated upon exposure to microbial pathogens and supports the bactericidal activity of phagocytes. The well-known mechanisms in the post-translational regulation of HIF-1α levels as well as its short half-life might therefore characterize HIF-1α as an attractive pharmacological target. HIF‑1α agonists that are designed to activate bactericidal mechanisms of host immune cells could conceivably be used alongside conventional antibiotics, and are predicted to function effectively against drug-resistant bacteria.

At first, the role of HIF-1α in the antimicrobial activities of mast cells (MCs) was investigated. Therefore, the new pharmacological agent AKB-4924 was used to inhibit prolyl hydroxylases involved in the HIF-1α degradation pathway and to subsequently increase HIF-1α protein levels. Enhancement of HIF-1α activity with AKB-4924 resulted in increased antimicrobial activity in human and murine MCs. Importantly, mast cell extracellular trap (MCET) formation was induced by treatment of mast cells with AKB-4924. Interestingly, inhibition of phagocytosis by using cytochalasin D in the presence or absence of AKB‑4924 did not affect the antimicrobial activity of the human mast cell line HMC-1 cells, confirming that an extracellular bactericidal activity is mediated by HIF‑1α. However, blocking the formation of reactive oxygen species (ROS) resulted in inhibited antimicrobial activity of HMC-1 cells. Additionally, bone marrow derived mast cells (BMMCs) isolated from HIF-1α deficient mice showed a significantly reduced antimicrobial effect against S. aureus compared to control BMMCs. Importantly, also the AKB-4924 mediated MCET formation was absent in those cells. Therefore, the obtained results indicate that the transcription factor HIF-1α is a key regulator of the extracellular antimicrobial activity and the formation of PETs in mast cells.

The second aim was to establish cell culture conditions using a surrogate neutrophil cell line (differentiated HL-60 leukocytes) to mimic primary neutrophils. Upon chemical differentiation of HL-60 cells with DMSO or all-trans retinoic acid, HL-60 cells do not exert similar antibacterial activities compared to blood-derived neutrophils. The development of neutrophil characteristics is therefore insufficient. Thus, we conclude that differentiated HL-60 cells are of limited value to replace primary cells in in vitro experiments to investigate antimicrobial activity and PET formation. Additionally, standardized culture protocols to analyze PET formation in primary neutrophils do not exist so far. Therefore, the most appropriate cell density and duration of PET induction experiments was evaluated using primary blood derived neutrophils. Best results in PET induction and visualization were obtained with primary blood derived neutrophils at a concentration of 2x106 cells /ml and a stimulation time of 3 hours. These conditions have thus been chosen for the following experiments.

The last aim was the evaluation of the role of iron chelating HIF-1α agonist in PET formation by neutrophils. Within this study it was shown that the iron chelating agent Desferrioxamine (DFO) boosts the formation of PETs in human and bovine primary blood derived neutrophils. Iron supplementation abolished that effect. Other HIF 1α-agonists showed a similar phenotype. Thus, it can be hypothesized that HIF‑1α might regulate key factors involved in PET formation and stabilization e.g. PAD4, ROS, elastase or LL‑37. This was proven experimentally by biochemically blocking respective enzyme function. In conclusion, these data have shown that HIF-1α might play an important role in the formation of PETs in neutrophils as well as mast cells. This knowledge will help to design drugs that could modulate innate immune cell functions against infections.

keywords

Neutrophile, antimikrobielle DNA Netze, HIF-1a, Neutrophil, NETs, HIF-1a

kb

18.053