Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Sophia Arlena Ulrich  

 

 

 Lungenwurminfektionen bei Robben und serologische Nachweismöglichkeiten

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108637

title (engl.)

Lungworm infections in seals and their serological detection 

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/ulrichs_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Die Robbenarten Seehund und Kegelrobbe sind neben Schweinswalen die einzigen heimischen Meeressäugetiere in deutschen Gewässern. Ein regelmäßiger Befund bei Obduktionen von Seehunden sind die Lungenwürmer Otostrongylus circumlitus und Parafilaroides gymnurus, die eine Obstruktion der Bronchien nach sich ziehen können. In Verbindung mit bakteriellen Sekundärinfektionen können sie zu schwerwiegenden Bronchopneumonien bis hin zum Tod der Tiere führen. Die Diagnose wurde bislang überwiegend beim toten Tier gestellt, da Larvenauswanderverfahren eine begrenzte Sensitivität aufweisen und zudem bei Seehunden in der Wildbahn nicht mit vertretbarem Aufwand durchführbar sind. Deshalb war es ein Ziel der vorliegenden Arbeit, eine serologische Nachweismöglichkeit von Lungenwürmern bei Seehunden und Kegelrobben zu etablieren. Hierfür wurde ein bestehender Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) für die Lungenwurmdetektion bei Rindern an Seehunde und Kegelrobben angepasst. Als Antigen wurde rekombinant exprimiertes Major Sperm Protein (MSP) von Dictyocaulus viviparus, dem Lungenwurm des Rindes, eingesetzt. MSP ist ein Spermienprotein, welches nur in adulten Nematoden exprimiert wird und demzufolge nur während der Patenz gebildete Antikörper nachweisen kann. Für die Evaluierung des ELISAs wurden Lungenwurm-positive und -negative Seren von Seehunden und Kegelrobben mittels horseradish peroxidase (HRP)-konjugiertem Protein A als Sekundärantikörper analysiert und über eine receiver operating characteristic (ROC)- Analyse ein Cut-off von 0,422 optischer Dichte (OD) bestimmt. Der Test zeigte signifikante Unterschiede zwischen den OD-Werten von Seren Lungenwurm-positiver und  negativer Tiere (P=<0,0001). Mit einer Sensitivität von 97,83 % und einer Spezifität von 100 % stellt der Assay eine wertvolle Methode zur Lungenwurmdetektion bei Seehunden und Kegelrobben dar.

Lungenwurminfektionen bei Robben sind nicht nur in Nordeuropa verbreitet, sondern sind auch bei kalifornischen Seeelefanten eine häufige Todesursache. Deshalb wurde die Übertragbarkeit des Assays auf diese Tiere getestet. Es wurden nur solche Seeelefanten als Lungenwurm-positiv im ELISA erkannt, bei denen mittels Auswanderverfahren Lungenwurmlarven nachgewiesen werden konnten. Kalifornische Seeelefanten sterben aber oft schon bevor die Parasiten Geschlechtsreife erlangen, sodass der ELISA nicht für diese Robbenspezies zu empfehlen ist, da dieser nur patente Infektionen detektiert.

Der ELISA wurde zur Bestimmung der Lungenwurmprävalenz bei freilebenden Seehunden (n=313) der deutschen Nordsee und des dänischen Kattegats, die in verschiedene Altersgruppen (AG) eingeteilt wurden, angewandt. Die Ergebnisse zeigten eine Gesamtprävalenz von 17,9 %. Die Seroprävalenz bei bis zu sechs Wochen alten Seehunden (AG 1) betrug 0,7 %, bei einem Alter bis zu sechs Monaten (AG 2) 88,9 %, bis zu 18 Monaten (AG 3) 53,6 % und bei adulten Tieren (AG 4) 24,5 %, was die Altersabhängigkeit der Infektion bestätigt. In AG 4 zeigten seropositive Tiere eine statistisch signifikante Reduktion des Körpergewichts (P=0,003) und der Körperlänge (P=<0,001). Seren von Lungenwurm-infizierten Seehunden (n=6) in Rehabilitation wurden mittels ELISA analysiert, um erste Informationen über die Persistenz von anti-Lungenwurm-Antikörpern zu erhalten. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Dauer der Antikörperpersistenz ähnlich der von Lungenwurm-infizierten Rindern zu sein scheint. Allerdings sind weitere Studien nötig, um diese Annahme zu verifizieren. MSP von neun Nematodenspezies, die bei Seehunden und Schweinswalen parasitieren, wurde aufgrund bislang fehlender Informationen molekularbiologisch charakterisiert. Die Ergebnisse bestätigen den hochkonservierten Charakter dieses nur bei Nematoden vorkommenden Spermienproteins. Phylogenetische Analysen mit MSP-Sequenzen von neun marinen und neun terrestrischen parasitischen Nematoden zeigten, dass MSP des Genus Dictyocaulus (Trichostrongyloidea) näher mit den Metastrongyloidea der marinen Säugetiere als mit den Trichostrongyloidea der terrestrischen Säugetiere verwandt ist. Weitere Studien mit einer größeren Anzahl an Genen sind notwendig, um dieses Ergebnis zu be- oder entkräftigen.

Der entwickelte ELISA ist eine gut geeignete Methode, um freilebende Seehunde auf Lungenwurmbefall zu untersuchen und die daraus resultierenden Daten sind für das Management und die Gesundheitsüberwachung der Seehundpopulation von großem Wert.

 

abstract (englisch)

The seal species harbour and grey seal are the only native marine mammals in German waters besides harbour porpoises. The lungworm species Otostrongylus circumlitus and Parafilaroides gymnurus are frequently found during necropsies of harbour seals and may cause obstruction of the bronchi. In connection with secondary bacterial infections, they can lead to severe bronchopneumonia and death of the animals. To date, diagnosis of the infection was mostly determined post mortem as the sensitivity of faecal larvae detection is limited and the method not logistically feasible for free-living seals. Therefore, the aim of the study was to establish a serological detection method for immunodiagnosis of lungworms in harbour and grey seals. Thus, an existing enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for lungworm detection in cattle was adapted to harbour and grey seals. Major sperm protein (MSP), isolated from the bovine lungworm Dictyocaulus viviparus, was used as recombinant antigen. MSP is a sperm protein that only occurs in adult nematodes and therefore is detected only in the patent phase of infection. For ELISA evaluation, lungworm-positive and -negative sera of harbour and grey seals were analysed using horseradish peroxidase (HRP)-conjugated Protein A as secondary antibody. A cut-off of 0.422 optical density (OD) was calculated by receiver operating characteristic (ROC) analysis. The test showed significant OD differences between lungworm-negative and -positive sera (P=<0.0001). The resulting sensitivity of 97.83% and specificity of 100% showed that the ELISA is a valuable tool for lungworm detection in harbour and grey seals.

Lungworm infections in seals are present outside of Northern Europe. They often cause death in northern elephant seals, native in California, USA, wherefore the transferability of the ELISA to northern elephant seals was tested. The ELISA detected only those specimens with positive faecal larvae results as lungworm-positive. However, as Northern elephant seals often die before the parasites reach adulthood, but the ELISA mostly detects patent infections, so the test cannot be recommended for use on northern elephant seals.

The ELISA was applied for the analysis of lungworm prevalence in free-living harbour seals including four different age groups (n=313) from the German North Sea and the Danish Kattegat. The results showed an overall lungworm seroprevalence of 17.9%. Animals up to six weeks old (age group [AG] 1) showed a seroprevalence of 0.7%, those up to six months (AG 2) of 88.9%, up to 18 months (AG 3) of 53.6% and adult animals (AG 4) of 24.5%, confirming an age-related infection. In AG 4, seropositive animals showed statistically significant reductions in body weight (P=0.003) and length (P<0.001). Sera from lungworm infected harbour seals (n=6) in rehabilitation were analysed with the ELISA, showing antibody-positive results in all samples at the arrival examination. Results revealed that duration of antibody persistence may be similar to that of lungworm infected cattle, but further studies are needed for confirmation.

MSP of nine nematode species infecting harbour seals and harbour porpoises was characterised molecularly, as information about their molecular structure was missing. Phylogenetic analyses of MSP sequences of nine marine and nine terrestrial mammal parasitic nematodes showed that lungworm MSP of the genus Dictyocaulus (Trichostrongyloidea) is more closely related to the Metastrongyloidea of marine mammals than to the Trichostrongyloidea of terrestrial hosts. As the analyses were conducted on one gene only, further studies are needed to verify or falsify this result.

The ELISA presented in this study is a suitable technique to screen free-living species for lungworm antibodies and the resulting data is valuable for the management and health surveillance of the harbour seal population.

 

keywords

Robben, Lungenwürmer, ELISA, Major Sperm Protein, Phoca vitulina, lungworm infection

kb

515