Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Witchaya Tongtako

In situ and in vitro characterization of canine and murine

satellite glial cells and canine neurons from dorsal root

ganglia

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-111008

title (ger.)

In situ und in vitro Charakterisierung von kaninen und murinen Satellitenzellen und kaninen neuron aus Dorsalwurzelganglien

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/tongtakow_ws17.pdf

abstract (deutsch)

Dorsalwurzelganglien (DRG) finden sich bilateral des Rückenmarks innerhalb der Spinalnerven, welche den Wirbelkanal durch die Foramina intervertebralia verlassen. DRG bestehen aus pseudounipolaren Neuronen und Satellitenzellen, welche von einem dünnen fibrösen Gewebe umgeben sind. DRG übermitteln sensorische Informationen aus der Peripherie an das zentrale Nervensystem (ZNS). Darüber hinaus werden Signale in den DRG durch Neurone und Satellitenzellen moduliert und modifiziert bevor sie in das Rückenmark gelangen. Viele Studien zeigen, dass die DRG-Zellen an Prozessen der Schmerzempfindung und Virusinfektionen zum Beispiel mit dem humanen Immundefizienz-Virus beteiligt sind. Zudem reagieren residente Zellen in den DRG unter physiologischen und pathologischen Bedingungen, wie Nervenschädigungen, auf eine Vielzahl an Wachstumsfaktoren und spezifischen Proteinen. Viele Studien zur Untersuchung der spezifischen Zusammensetzung, Funktion und Struktur von Dorsalganglien wurden sowohl in vitro, als auch ex vivo und in vivo durchgeführt. In einer in vitro Studie wurde gezeigt, dass sich isolierte Satellitenzellen aus embryonalen Ratten sowohl in Astrozyten als auch Oligodendrozyten und Schwann Zellen differenzieren lassen. Zudem wurde in früheren Studien dargestellt, dass Spezies-spezifische Eigenschaften und pathogenetische Mechanismen von ZNS-Läsionen eine hohe Ähnlichkeit bei Mensch und Hund zeigen. Allerdings muss hierbei berücksichtigt werden, dass die Eigenschaften und Funktionen der kaninen DRG-Neurone und -Satellitenzellen bisher kaum untersucht sind. Deshalb sind die Ziele der durchgeführten Studie zum einen (i) die vergleichende Untersuchung morphologischer und funktioneller Eigenschaften von kaninen und murinen Satellitenzellen und (ii) die Analyse der morphologischen und funktionellen Veränderungen, welche durch GM1 Ganglioside in vitro in DRG-Neuronen hervorgerufen werden.

 

Immunhistologisch wurde gezeigt, dass kanine Satellitenzellen sowohl in situ als auch in vitro eine Ko-Expression von 2',3'-Cyclic Nucleotide 3' Phosphodiesterase (CNPase) und saurem Gliafaserprotein (GFAP) aufweisen, wohingegen murine Satellitenzellen dies überwiegend nur in vitro exprimieren. Eine geringe Expression von Glutaminsynthetase (GS) war in kaninen Satellitenzellen zu finden, während murine Satellitenzellen eine ausgeprägte Expression dieses für murine Satellitenzellen typischen Markers aufwiesen. Interessanterweise zeigten Satellitenzellen von nicht-humanen Primaten eine Expression von allen Markern, d.h. GFAP, CNPase und GS, in ihren Satellitenzellen. Des Weiteren exprimieren kanine Satellitenzellen zudem die Marker Sox2 und Nestin, welche üblicherweise insbesondere in neuronalen Vorläuferzellen zu finden sind. Mittels rasterelektronenmikroskopischer Untersuchungen waren in vitro morphologisch unterschiedliche Populationen von kaninen und murinen Satellitenzellen zu finden, welche in kleine und runde, spindeloide, abgeflachte fibroblastoide und multipolare Zellen eingeteilt wurden. Allerdings fanden sich in murinen Satellitenzellen mehr runde und fibroblastoide Zellen im Vergleich zum Hund. Zudem fanden sich Unterschiede zwischen murinen und kaninen Satellitenzellen im Hinblick auf ihre Antwort auf bestimmte Wachstumsfaktoren (Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)-2, Epidermaler Wachstumsfaktor, ziliärer neurotropher Faktor, Heregulin 1β) bezüglich ihrer Proliferation und GFAP-Expression. Knochenmorphogenetisches Protein 4 (BMP4) verursachte in beiden Spezies eine gesteigerte Expression von GFAP. Zudem wiesen die kaninen Neurone ein gesteigertes Neuritenwachstum auf, wenn sie mit kaninen Satellitenzellen ko-kultiviert wurden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Satellitenzellen Gliazellen mit außergewöhnlichen Eigenschaften darstellen, welche möglicherweise in der Therapie von humanen und kaninen Erkrankungen des ZNS wie den Rückenmarkstraumata benutzt werden können.

 

GM1 Ganglioside sind sowohl an physiologischen Prozessen als auch an humanen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Im Rahmen einer in vitro-Studie wurde der Einfluss von GM1 auf das Auswachsen von Neuriten, die Expression von Strukturproteinen und funktionelle Eigenschaften von kaninen DRG-Neuronen näher untersucht. Darüber hinaus wurden Wechselwirkungen zwischen  GM1 und zwei neurotrophen Faktoren nämlich Nerven Wachstumsfaktor (NGF) und FGF-2 analysiert. GM1 und NGF stimulieren das Auswachsen von Neuriten, reduzieren neuronale Apoptosen, induzieren die Ansammlung von Dynein und Synaptophysin sowie die Akkumulation von Mitochondrien in Neuriten und steigern zudem die Anzahl zytoplasmatischer multivesikulärer Körperchen. Diese Effekte können sowohl auf neurotrophe, den axonalen Transport beeinflussende Eigenschaften hinweisen, als auch an Prozessen der Autophagie beteiligt sein. GM1 senkt zudem das das Ruhepotential der Zellmembran und reduziert den Grenzwert des Aktionspotentials und die Depolarisationsgeschwindigkeit in DRG Neuronen. Des Weiteren wurde in vorliegenden Studie eine FGF-2-induzierte Tau-1 Expression nachgewiesen, welche möglicherweise die Bildung von neurofibrillären Bündeln begünstigt. Diese Befunde zeigen, dass kanine-DRG Neurone ein geeignetes, translationales in vitro-Modell zur Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen darstellen.

abstract (englisch)

Dorsal root ganglia (DRG) are located bilaterally in the spinal nerves at the level of the intervertebral foramina. DRG are composed of pseudounipolar neurons and satellite glial cells (SGCs), which are enclosed by fibrous connective tissue. DRG transmit sensory information from the periphery to the central nervous system (CNS). In addition, both neurons and SGCs modulate and modify signals before the information passes through the ganglion to the spinal cord. Many studies describe that the cellular components in DRG are involved in pain sensation and infections of viruses. DRG resident cells also respond to several growth factors and specific proteins in physiologic and pathologic conditions including nerve injury. According to the structure, properties, and functions of DRG, several in vivo experiments, ex vivo tissue studies, and in vitro studies with isolated cells have been performed. Interestingly, an in vitro study showed that SGCs isolated from the DRG of embryonic and postnatal rats can differentiate into astrocytes, oligodendrocytes, and Schwann cells. In addition, previous studies demonstrated that species-specific properties of glial cells and pathogenetic mechanisms of CNS lesions are highly similar between humans and dogs. However, properties and functions of canine DRG neurons and SGCs have hardly been investigated. Therefore, the aims of this study were (i) to investigate and compare morphological features and functional properties of canine and murine SGCs and (ii) to analyze the morphological and functional changes induced by GM1 ganglioside in canine dorsal root ganglia neurons in vitro.

 

Immunostainings demonstrated that canine SGCs co-express glial fibrillary acidic protein (GFAP) and 2',3'-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase) both in situ and in vitro, whereas murine SGCs express both markers predominantly in vitro. A low expression of glutamine synthetase (GS) was found in canine SGCs, whereas most murine SGCs were positive for this prototypical rodent SGCs marker. Interestingly, simian SGCs generally expressed GFAP, CNPase, and GS. Furthermore, canine SGCs also expressed Sox2 and nestin, which are markers for neuronal progenitor cells. A scanning electron microscope was used to study cultured canine and murine SGCs and demonstrated small round cells, spindeloid, flattened fibroblastoid and multipolar cells in both species. Nevertheless, murine compared to canine SGC cultures contained more round and larger fibroblastoid cells. Differences between canine and murine SGCs were also noticed in their response to growth factors (fibroblast growth factor (FGF) 2, epidermal growth factor, ciliary neurotrophic factor, heregulin 1β) with respect to proliferation and GFAP expression. However, GFAP expression was induced in SGCs of both species if supplemented with bone morphogenetic protein 4. Moreover, canine SGCs co-cultured with neurons induced neurite outgrowth. Summarized, SGCs possess exceptional glial cells properties and might be interesting candidates for the treatment of degenerative disorders of the human and canine CNS such as spinal cord injury.

 

GM1 ganglioside plays an important role in various physiological processes and neurodegenerative diseases. To further elucidate the effects of GM1 on neurons, the present study analyzed the influence of GM1 on neurite outgrowth, the expression of structural proteins, and functional properties of canine DRG neurons in vitro. Moreover, interactions of GM1 and two neurotrophic factors namely nerve growth factor (NGF) and FGF-2 were investigated. GM1 and NGF stimulated neurite outgrowth, reduced neuronal apoptosis, induced dynein and synaptophysin accumulations and clusters of mitochondria in neurites, and increased the number of cytoplasmic multivesicular bodies indicating neurotrophic properties and effects on axonal transport and autophagic pathways, respectively. GM1 also decreased resting membrane potential and reduces the action potential threshold and the depolarization speed of DRG neurons. In addition, the present study demonstrated an FGF2-mediated increase in Tau1 expression, which might favor the formation neurofibrillary tangles typically found in Alzheimer’s disease. Consequently, cultures of canine DRG neurons represent a suitable translational in vitro model to study neurodegenerative disorders.

keywords

Satellitenzellen, Kaninen Neuronen, Dorsalwurzelganglien, satellite glial cells, canine neuron, dorsal root ganglion

kb

8.802