Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Anna Thomsen

Untersuchungen zum Stoffwechsel von Aminen und

Polyaminen bei Einsatz von Grassilagen mit

unterschiedlichen Reineiweißgehalten unter Zulage

von Soja im Pansen in vitro

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-111670

title (eng.)

Studies on the metabolism of amines when feeding grass silage containing different levels of true protein and the influence of soybean meal using the RUSITEC-System

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2018

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/thomsena_ss18.pdf

abstract (deutsch)

Seit dem Jahr 2005 besteht Grund zur Annahme, dass die Fütterung von Grassilagen mit einem prozentual niedrigen Reineiweißanteil am Rohprotein von RE/Rp < 50 % die nutritive Ursache für das unspezifische Krankheitsbild der „Faktorenerkrankung Milchvieh­herde“ in norddeutschen Milchviehbetrieben ist. Eine frühzeitige Ergänzung der Ration mit Sojaextraktionsschrot als alternative Protein­quelle konnte das Krankheits­geschehen abfangen.

 

Vorangegangene Untersuchungen zum Einfluss von entsprechenden Schadsilagen auf die Fermentation im Langzeitinkubationssystem RUSITEC konnten einen Anstieg von sekundären Pflanzen­stoffen, freien Aminosäuren sowie eine Verschiebung der Fermentations­produkte Ammoniak, flüchtige Fettsäuren und des Gasvolumens und der Gaszusammensetzung durch eine Veränderung der mikrobiellen Flora aufzeigen. Der Schwerpunkt dieser Dissertation lag auf dem Stoffwechsel von potentiell schädlichen Aminen und Polyaminen im RUSITEC bei Fermentation von Grassilagen mit einem Quotienten von RE/Rp < 50 % und dem Einfluss einer Sojazulage.

 

Als in-vitro-Modell des Pansens wurde der RUSITEC mit sechs Fermentern in acht Läufen à 28 Tage verwendet. Die eingesetzten Futtermittel bestanden aus zwei Kontroll- und zwei Schadsilagen (RE/Rp >50 % bzw. RE/Rp < 50 %), jeweils von derselben landwirt­schaft­lichen Nutzfläche, sodass Laufblock I (L31–L34) Schad- und Kontrollsilage von Betrieb A und Laufblock II (L35–L38) entsprechend Schad- und Kontrollsilage von Betrieb B enthielten. In allen sechs Fermentern wurde Maisstärke als Energiequelle hinzugegeben. Nach achttägiger Einlauf- und Kontrollphase wurde in die vier Test­fermenter Schadsilage gegeben und zwei dieser Fermenter wurden mit Sojaprotein supplementiert (zehntägige Zulagephase). Zwei Fermenter blieben über die gesamte Dauer als Kontrollfermenter mit unveränderter Fütterung bestehen. Am Ende schloss sich eine zehntägige Erholungsphase unter Kontrollsilagezusatz an.

 

Die Analyse der Polyamine erfolgte mit der LC-MS/MS (Flüssigchromatographie gekoppelt mit mehrfacher Massen­spektrometrie). Dafür wurde auf Basis der Untersuchungen von HÄKKINEN et al. (2007) eine geeignete modifizierte Methode entwickelt, um die löslichen Amine und Polyamine Cadaverin, Putrescin, Spermidin, Spermin, β-Alanin, GABA und m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) sowie die korrespondierenden Aminosäuren ohne Derivatisierung im flüssigen und im festen Fermenterinhalt zu detektieren. Zudem wurde Ammoniak mittels Ammoniakelektrode und die flüchtigen i-Fettsäuren i-Butter- und

 i-Valeriansäure gaschromato­grafisch bestimmt.

 

In den Ergebnissen zeigte sich, dass die Fermentation von Schadsilagen im flüssigen Fermenterinhalt des RUSITECs während der Zulagephase (Tag 10–19) mit Ausnahme von Cadaverin und GABA zu geringeren Polyamin­gehalten von -13,5 bis -60,3 % im Vergleich zur Kontrolle führte. Cadaverin und GABA zeigten im ersten Laufblock ebenfalls geringere Gehalte in den Testfermentern gegenüber der Kontrollfermenter (-13,2 bzw. -36,1 %), im zweiten Laufblock hingegen war die Abweichung zu den Kontrollen positiv (+9,8 bzw. 127 %). Die korrespondierenden Aminosäuren waren unter Schadsilagezulage im flüssigen Fermenterinhalt erhöht (+1,6 bis +25,4 %).

 

Auch im festen Fermenterinhalt aus den Futtersäcken (nach 48 Stunden Inkubation) wurden unter Schadsilagefermentation im Vergleich zur Kontrollsilagefermentation während der Zulagephase geringere Amingehalte detektiert (-7,8 bis -43,9 %). Ausnahmen bildeten hier Cadaverin mit geringgradig positiven Abweichungen der Testfermenter von +1,8 bis +3,7 %, β-Alanin und m/z 173 (möglicherweise Thermospermin) mit entgegen gerichteten Abweichungen in den Laufblöcken (L31–L34: +9,3 % bzw. -48,2 % und L35–L38: -44,3 % bzw. +14,6 %) und GABA mit positiven Abweichungen von den Kontrollfermentern, die im zweiten Laufblock deutlich höher waren (L31–L34: +33,3 % bzw. L35–L38: +88,7 %).

 

Mit Ausnahme von L-Arginin, welches im zweiten Laufblock negative Abweichungen in den Testfermentern gegenüber der Kontroll­fermenter von -11,8 % aufwies, waren die korrespondierenden Aminosäuren unter Schadsilagezusatz im festen Fermenterinhalt des RUSITECS erhöht (+4,6 bis +54,3 %). L-Lysin verhielt sich wieder entgegengesetzt mit Abweichungen von -86,6 % im ersten Laufblock und +82,1 % im zweiten Laufblock gegenüber der jeweiligen Kontrolle.

 

Die Sojazulage konnte in allen acht Läufen keinen signifikanten Unterschied im Amingehalt der Testfermenter hervorrufen. Die flüchtigen i-Fettsäuren und Ammoniak hingegen wurden durch die Schadsilage in beiden Laufblöcken deutlich erhöht und die Sojazulage führte zu einer weiteren Steigerung dieser Parameter im Vergleich zu den Kontrollen.

 

Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wird ersichtlich, dass die Fütterung von Schadsilagen mit einem RE/Rp < 50 % im RUSITEC zu reduzierten Amin- und erhöhten freien Aminosäure­gehalten führte. Es konnte ein Zusammenhang zwischen den Aminen bzw. Polyaminen und ihren korrespondierenden Amino­säuren im RUSITEC hergestellt werden und es wurde versucht die Komplexität und den zeitlichen Ablauf der Amin­synthese und des Aminkatabolismus aufzuzeigen. Zudem spiegelte sich eine deutliche Verschiebung der Mikroflora in den Ergebnissen von Ammoniak- und den flüchtigen i-Fettsäuren des in-vitro-Systems wider. Der in der Praxis beschriebene positive Effekt der Sojazulage hingegen konnte nicht hinreichend erklärt werden. Allerdings deuten die Ammoniak- und i-Butter- bzw. i-Valerian­säure­ergebnisse darauf hin, dass die Sojazulage in den mit Schadsilage bestückten Fermentern möglicherweise die Desaminierung durch die HAP-Spezies und Megasphaera elsdenii fördert. Dies müsste in weiteren Unter­suchungen überprüft werden.

 

Der Fokus der Arbeit lag auf der Reaktivität und möglichen Toxizität der längerkettigen Amine für den Wiederkäuer. Da die Amine in sehr geringen Gehalten nachgewiesen wurden, ist eine toxische Wirkung der Amine per se durch den Einsatz von Grassilagen mit geringen Reineiweiß­gehalten am Rohprotein nicht anzunehmen. Offen hingegen bleibt, inwiefern speziell Polyamine im Pansen Komplexe bilden und dadurch schädliches Potential entwickeln können.

abstract (englisch)

Evidences suggest that feeding grass silages low in the ratio of true protein in total crude protein (< 50 % TP/CP) is a nutrient factor of an unspecific health threatening disease called “Faktorenerkrankung Milchviehherde” in dairy cows since 2005. The early addition of soy protein helped to prevent severe propagation of the disease.

Previous investigations about the fermentation of grass silages low in true protein in the in vitro system of the rumen called RUSITEC led to increased levels of secondary plant metabolites and free amino acids. In these investigations they could also determine a shift in ammonia, in branched short chain fatty acids (BSCFA), in gaseous volumina and composition as well as in the rumen microbiome.

This study was conducted to investigate the metabolism of amines and especially polyamines in the RUSITEC-system when feeding grass silages of a TP/CP ratio less than 50 % and the influence of the addition of soy protein.

Therefore, eight digestive experiments lasting 28 days each in the RUSITEC-system containing six fermenters were completed. Both types of grass silages (low: < 50 % vs. high: > 50 % in TP/CP ratio) were collected from the same cultivated pastureland of two different dairy farms in northern Germany, minimizing the botanical influence. Two blocks of digestive experiments were performed (L31–L34: dairy farm A and L35–L38: dairy farm B). Corn starch was added for energy to all six fermenters of the RUSITEC. After the first eight days to initiate a balanced fermentation while feeding control grass silage, four fermenters were replaced with test grass silage (< 50 % TP/CP) of which two were supplemented with soy protein. This experimental stage lasted for ten days. In the final recovery stage from day 20–28 control grass silage was added again to all fermenters.

Amines and polyamines and corresponding amino acids were analyzed using a liquid chroma­tography system linked to a mass spectrometry detector (LC-MS/MS). A new method without derivatization was developed on basis of HÄKKINEN et al. (2007) to determine the soluble amines and polyamines cadaverine, putrescine, spermidine, spermine, β-Alanine, GABA and m/z 173 (possibly thermospermine) as well as the corresponding amino acids in the liquid and solid phase of the RUSITEC samples. Ammonia was measured via ammonia electrode and BSCFA were detected by gas chromatography.

The results of the experimental stage in the liquid fermentation samples of the RUSITEC showed lower levels of amines in test fermenters compared to the control fermenters (-13.5 % to -60.3 %) except for cadaverine and GABA. In the first block cadaverine and GABA had also lower levels (-13.2 % and -36.1 %, resp.) whereas the second block had positive deviations in test fermenters vs. control fermenters (+9.8 % and +127 %, resp.). The corresponding amino acids had higher amounts in fermenters fed with test grass silage compared to control (between +1.6 % and +25.4 %).

The solid RUSITEC samples were collected from the feeding bags after 48 hours of incubation. Lower analogous amine levels were noted as well during the experimental period (-7.8 % to -43.9 %). A different result was found for cadaverine in test fermenters leading to very little positive deviations from control fermenters (+1.8 % to +3.7 %), whereas β-Alanine and m/z 173 (possibly thermospermine) had contrary results. The first block (L31–L34) had +9.3 % and -48.2 % for β-Alanine and m/z 173 in test fermenters in comparison to control fermenters and the second block (L35–L38) had -44.3 % and +14.6 % respectively. Another exclusion was notable in the results of GABA which were positive throughout both blocks in solid samples, but in the second block even higher (L31–L34: +33.3 % and L35–L38: +88.7 % resp.).

The corres­ponding amino acids tended to have negative deviations
(-11.8 %), except for L-arginine (+4.6 to +54.3 %). L-lysine in test fermenters had contrary results again noting -86,6 % in the first and +82,1 % in the second run compared to control fermenters.

The addition of soy protein did not reveal significantly different results in amines and polyamines. Ammonia and BSCFA were higher in test fermenters compared to control fermenters and soy protein addition resulted in significantly higher levels for those parameters.

 

Summarizing all findings, it is obvious that feeding grass silages of TP/CP ratios < 50 % results basically in lower levels of amines and polyamines and higher amounts of free amino acids. We were able to show a connection between amino acids and amines and especially polyamines in the RUSITEC system with regard to their fast and complex metabolism and the wide range of influences. The results of ammonia and BSCFA could be explained by a shift in the rumen microbiome. The positive effect of the addition of soy protein in dairy herds could not be explained, but increased BSCFA and ammonia in test fermenters added with soy protein are supposed to be promotional to the deaminating bacteria Megasphaera elsdenii and HAP-Species. This still needs to be confirmed in further investigations.

Main point of the investigations was to evaluate the reactivity and toxicity of long chained amines in cattle. Since the amounts of polyamines analyzed in the RUSITEC system were relatively small, a toxic potential of polyamines when feeding grass silages low in true protein is not assumed. Still pending is the potential feature of polyamines to build harmful complexes in the rumen and their influence on the dairy herd health.

keywords

Amine, Reinweiweißgehalt, Soja, Amines, true protein, soy

kb

5.228