Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Maike Teuber

Monitoring von antithrombotischen Medikamenten

bei der Katze

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110980

title (eng.)

Monitoring of antithrombotic drugs in cats

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/teuberm_ws17.pdf

abstract (deutsch)

Im ersten Teil der vorliegenden Studie wurde anhand der Wirkung auf die Ergebnisse des Plättchenfunktionsanalysegerätes PFA-100® und die Vollblutaggregometrie untersucht, ob der Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel in reduzierter täglichen Dosis vom 10 mg/Katze dieselbe Effektivität wie die derzeitige Standarddosis von 18,75 mg (1/4 75 mg Tablette) aufweist. Im methodischen Vorversuch wurde u. a. die Eignung des Plättchenfunktionanalysegerätes PFA-100® zur Messung von Katzenblut evaluiert. Dafür wurden von 59 klinisch gesunden Katzen, ohne Abweichungen im hämatologischen oder klinisch-chemischen Blutprofil, gepufferte Citratblutproben getestet und Referenzwerte mittels 2,5%- und 97,5%-Quantil erstellt. Darüber hinaus wurden für die Impedanz-Aggregometrie mit dem Multiplate®-Analyser im mit Hirudin antikoagulierten Blut verschiedene Konzentrationen der Agonisten ADP, Arachidonsäure und Kollagen getestet, um für die Katze optimierte Konzentrationen zu ermitteln. Im Hauptversuch haben zwei Gruppen von sechs Katzen einmal täglich entweder 10 mg bzw. 18,75 mg Clopidogrel über sieben Tage erhalten. Nach definierten Zeitpunkten an den Tagen 1, 2, 3, 5 und 7 wurde den Katzen einmal täglich für die Messung mittels Plättchenfunktionanalysegerät und Multiplate®-Analyser eine gepufferte Citrat- und eine Hirudinblutprobe entnommen.

 

Unter Verwendung der Kollagen/ADP-Testkartusche wurde ein Referenzbereich für die Verschlusszeit des Plättchenfunktionanalysegerätes von 48–205 Sekunden ermittelt, während 9/52 Messungen mit der Kollagen/Epinephrin-Testkartusche den Messbereich überschritten. Aggregationsergebnisse mit dem Multiplate®-Analyser zeigten eine deutliche interindividuelle Variation, wobei Agonistenendkonzentrationen von (2–)5 µmol/l ADP, (0,2–)0,5 mmol/l Arachidonsäure und 2 (1–3) µg/ml Kollagen geeignet erscheinen. Im Hauptversuch zeigten beide Clopidogreldosierungen im Vergleich zum Ausgangswert einen signifikanten hemmenden Effekt auf die Ergebnisse des Plättchenfunktionsanalysegerätes und die Geschwindigkeit (velocity) der mit 2,5 oder 5 µmol/l ADP induzierten Plättchenaggregation (P < 0,05). Lediglich am ersten Tag zeigten die Katzen, die 10 mg Clopidogrel erhalten haben, keine signifikanten Veränderungen in der Verschlusszeit des Plättchenfunktionsanalysegerätes und in der mit 5 µmol/l ADP induzierten Plättchenaggregation. Die beiden Clopidogreldosierungen im Vergleich zeigten an keinem Tag signifikante Unterschiede zwischen den gemessenen Werten.

 

Der zweite Teil dieser Studie befasste sich mit der Etablierung der Messung der endogenen Thrombingenerierung (TG) nach der „Calibrated automated Thrombography“ (CAT)-Methode bei der Katze, unter besonderer Berücksichtigung ihrer Verwendbarkeit zum Monitoring des antikoagulatorischen Effektes des neuen oralen Faktor Xa-Hemmers Apixaban. Der methodische Vorversuch diente der Überprüfung der Präzision und der Erstellung der Referenzwerte aller Parameter der TG beim Einsatz von kommerziellen Aktivatorreagenzien mit verschiedenen Tissue Factor (TF)-Konzentrationen. Dafür wurden von 58 klinisch gesunden Katzen Blutproben gewonnen. Die gepufferten plättchenarmen Citratblutproben wurden in Aliquots portioniert und bei -80°C bis zur Untersuchung eingefroren. Für die Untersuchung der TG standen drei verschiedenen TF-Reagenzien für die Messung von plättchenarmem Plasma (platelet poor plasma, PPP) zur Verfügung (PPP Reagent 1 pM, PPP Reagent 5 pM, PPP Reagent 20 pM). Jede Messung wurde als Dreifachbestimmung durchgeführt und daraus der Median für die weiteren Berechnungen ermittelt. Die Referenzwerte wurden mittels 2,5%- und 97,5%-Quantil bestimmt. Im Hauptversuch bekamen 6 Katzen einmalig 2,5 mg Apixaban verabreicht. Vor der Tablettengabe und 2, 4, 6 und 8 Stunden danach wurden den Katzen Citratblutproben entnommen und neben der TG auch die Apixabankonzentration (über die Anti-Xa-Aktivität), Thrombelastometrie, Prothrombinzeit (PT), aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) und der Hämatokritwert gemessen.

 

Die Variantionskoeffizienten (VKs) für die Dreifachmessung zur Bestimmung der Referenzwerte lagen im Median bei unter 10 %. Die einzige Ausnahme bildete der Thrombinpeak beim PPP Reagent 1 pM (14,6 %). Die niedrigsten VKs ergaben sich für PPP Reagent 20 pM. Geringfügig bis moderat höhere VKs wurden für die Messung von Proben von Katzen errechnet, die mit Apixaban antikoaguliert worden waren. Die Referenzwerte aller Messgrößen der TG wiesen deutliche Unterschiede bezüglich des verwendeten TF-Reagenzes auf. Erwartungsgemäß nahmen die Latenzzeit und Reaktionsdauer mit steigender Konzentration ab und der Thrombinpeak zu. Nach oraler Gabe von 2,5 mg Apixaban an Katzen wurden maximale Apixabankonzentrationen (gemessen basierend auf der Anti-Xa-Akivität) nach 2 Stunden (Median 458 mg/ml) erzielt, wobei diese bis zum Versuchsende wieder deutlich abfielen. Apixaban hatte einen signifikanten Einfluss auf alle Parameter der TG. Auch hier war das Ausmaß der Auswirkung abhängig von der verwendeten TF-Konzentration. Das endogene Thrombinpotential reagierte am wenigsten sensitiv im Vergleich zu den anderen TG-Parametern. Weniger sensitiv gegenüber dem Effekt von Apixaban im Katzenblut waren die Gerinnungstests PT und aPTT, obgleich sie signifikante Veränderungen aufwiesen. Die Ergebnisse der Thrombelastometrie wurden von Apixaban nur sehr partiell beeinflusst. Enge Korrelationen zur Apixabankonzen-tration fanden sich für verschiedene TG-Parameter, besonders die Reaktionsdauer (rS = 0,789 [PPP Reagent 5 pM]; rS = 0,880 [PPP Reagent 20 pM]) und auch Latenzzeit, während die übrigen Hämostasetests allenfalls moderat enge Korrelationen zur Apixabankonzentration aufwiesen.

 

Die Ergebnisse des ersten Studienteils zeigen auf, dass eine tägliche Dosis von 10 mg Clopidogrel pro Katze, gemessen an den verwendeten Methoden, genauso effektiv in der Wirkung ist wie 18,75 mg. Allerdings wäre es hierbei von Vorteil, eine höhere Initialdosis zu verwenden, um schneller einen wirksamen Blutspiegel zu erreichen. Diese ex-vivo Ergebnisse müssen noch in klinischen Wirksamkeitsstudien bestätigt werden. Zudem deutet sich die Verwendbarkeit des Plättchenfunktionsanalysegerätes PFA-100® mit Kollagen/ADP-Testkartuschen für das Monitoring von Aggregationshemmern bei der Katze an.

 

Der zweite Studienteil lässt erkennen, dass sich die TG für die Messung von Katzenplasma einschließlich des Monitorings einer Therapie von Apixaban eignet. Für Letzteres sind PPP Reagent 5 pM, PPP Reagent 20 pM zu bevorzugen. Die PT, aPTT und Thrombelastometrie sind hingegen deutlich insensitiver und damit ungeeignet für das Apixabanmonitoring bei der Katze. Des Weiteren scheint der Faktor Xa-Hemmer Apixaban von der Katze in einer einmaligen Dosierung gut vertragen zu werden. Es bleibt allerdings noch zu klären, welches die optimale Dosis für Katzen ist und ob eine wiederholte Gabe genauso gut vertragen wird.

abstract (englisch)

In the first part of this study, with the effect on the results of the platelet function analyser PFA-100® and whole blood aggregometry it was investigated whether the reduced daily dose of 10 mg/cat of platelet aggregation inhibitor clopidogrel was as effective as the current standard dose of 18.75 mg (1/4 75 mg tablet). The methodical preliminary experiment evaluated i.a. the suitability of the platelet function analyser PFA-100® for the measurement of cat blood. For this purpose, buffered citrated blood samples of 59 clinically healthy cats, without deviations in the haematological or clinical-chemical blood profile were tested, and reference values ​​were calculated using 2.5 %- and 97.5 %-quantiles. In addition, various concentrations of the agonists ADP, arachidonic acid and collagen were tested in hirudin-anticoagulated blood for the impedance aggregometry using the Multiplate® analyser in order to determine optimised concentrations for the cat. In the main experiment, two groups of six cats received either 10 mg or 18.75 mg of clopidogrel once daily for seven days. After defined time points on days 1, 2, 3, 5 and 7, a buffered citrated and a hirudin-anticoagulated blood sample were drawn from the cats once a day for the measurement with the platelet function analyser and Multiplate® analyser.

 

Using the collagen/ADP test cartridge, a reference range for the closure time of the platelet function analyser was determined at 48–205 seconds while 9/52 measurements with the collagen/epinephrine test cartridge exceeded the measurement range. Aggregation results with the Multiplate® analyser showed a clear interindividual variation, with agonist concentrations of (2–)5 μmol/l of ADP, (0.2–)0.5 mmol/l of arachidonic acid, and 2 (1–3) μg/ml of collagen being suitable. In the main experiment, both clopidogrel dosages showed a significant inhibitory effect on the results of the platelet function analyser and the velocity of the platelet aggregation induced with 2.5 or 5 μmol/l ADP compared to the initial value (P < 0.05). Only on the first day, the cats who received 10 mg of clopidogrel showed no significant changes in the closure time of the platelet function analyser and in the platelet aggregation induced with 5 μmol/l ADP. The two clopidogrel dosages in comparison showed no significant differences between the measured values.

 

The second part of this study dealt with the establishment of the measurement of en-dogenous thrombin generation (TG) using the "Calibrated automated Thrombography" (CAT)-method in the cat, with particular regard to its suitability for monitoring the anticoagulatory effect of the new oral factor Xa inhibitor apixaban. The methodological preliminary experiment was used to verify the precision and for the creation of reference values ​​of all TG variables when using commercial activator reagents with different tissue factor (TF)-concentrations. For this purpose, blood samples were collected from 58 clinically healthy cats. The buffered platelet-poor citrate blood samples were separated into aliquots and frozen at -80°C until examination. Three different TF-reagents were available for the investigation of the TG for the measurement of platelet poor plasma (PPP) (PPP Reagent 1 μM, PPP Reagent 5 μM, PPP Reagent 20 μM). Each measurement was performed in triplicate and the median values were used for the further calculations. The reference values ​​were defined using 2.5 %- and 97.5 %- quantiles. In the main experiment 6 cats were given a single dose of 2.5 mg apixaban. Prior to tablet administration and 2, 4, 6 and 8 hours thereafter, citrated blood samples were taken from cats to measure the TG, the apixaban concentration (via the anti-Xa activity), thrombelastometry, prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (aPTT), and the haematocrit.

 

Coefficients of variation (CVs) for the triple measurement to determine the reference values ​​were on average (median) below 10 %. The only exception was the thrombin peak measured with PPP Reagent 1 pM (14.6 %). The lowest CVs were found for PPP Reagent 20 pM. Slightly to moderately higher CVs were calculated for the measurement of samples of cats that had been anticoagulated with apixaban. The reference values ​​of all TG variables showed distinct differences relating to the TF-reagent used. As expected, the lag time and reaction time (start tail) decreased with increasing concentration and the thrombin peak increased. After oral administration of 2.5 mg of apixaban to cats, maximum apixaban concentrations (measured based on anti-Xa activity) were achieved after 2 hours (median 458 mg/ml), which decreased significantly until the end of the experiment. Apixaban had a significant effect on all parameters of the TG. The extent of the effect was dependent on the TF-concentration used. The endogenous thrombin potential reacted least sensitively compared to the other TG variables. Less sensitive to the effect of apixaban in cat blood were the coagulation tests PT and aPTT, although they showed significant changes. The results of the thrombelastometry were only very partially influenced by apixaban. Close correlations to the apixaban concentration were found for different TG variables, especially the reaction time (rS = 0.789 [PPP Reagent 5 pM], rS = 0.880 [PPP Reagent 20 pM]) and also the lag time, while the other haemostasis tests had only moderately close correlations to the apixaban concentration.

 

The results of the first part of the study show that a daily dose of 10 mg Clopidogrel per cat, as measured by the methods used, is as effective as 18.75 mg per cat. However, it would be advantageous to use a higher initial dose in order to achieve an effective blood level faster. These ex vivo results must be confirmed in clinical efficacy studies. In addition, our results indicate the usability of the platelet function analyser PFA-100® with collagen/ADP test cartridges for the monitoring of aggregation inhibitors in cats.

 

The second part of the study shows that the TG is suitable for the measurement of cat plasma including the monitoring of apixaban therapy. For the latter the TF-reagents PPP Reagent 5 pM and PPP Reagent 20 pM are preferred. The PT, aPTT and thrombelastometry, on the other hand, are significantly less sensitive and therefore unsuitable for apixaban monitoring in cats. Furthermore, the factor Xa inhibitor Apixaban seems to be well tolerated by the cat in a single dosage. It remains to clarify, which is the optimal dose for cats and whether a repeated dose is just as well tolerated.

keywords

Katze, Plättchenfunktion, Thrombingenerierung, feline, platlet fuction, thrombin generation

kb

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