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abstract (deutsch)
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Eine Vielzahl von
Studien belegen, dass Schwann-Zellen und olfaktorische Hüllzellen (olfactory ensheathing cells; OECs)
eng verwandt sind und axonales Wachstum und Remyelinisierung nach Transplantation in das verletzte
Nervensystem fördern. Da bislang fast ausschließlich das Nagermodell
untersucht wurde, ist unklar, inwiefern die Daten auf den Menschen
übertragbar sind. Die Staupevirus (canine distemper virus; CDV) Infektion adulter
Hunde ist ein alternatives Tiermodell zum Studium demyelinisierender
Erkrankungen wie z.B. der Multiplen Sklerose. Kürzlich konnte gezeigt werden,
dass CDV über die Infektion olfaktorischer Neurone
in das Gehirn eintreten kann. Inwieweit OECs und
die Schwann-Zellen des peripheren Nervs natürliche
Ziele für das Staupevirus darstellen, ist unklar.
Auf der Grundlage
dieser Daten wurden Schwann-Zellen und OECs in der vorliegenden Arbeit zum Zwecke der Immortalisierung und Etablierung einer stabilen Quelle regenerationsfördernder Gliazellen
mit ektoper humaner Telomerase
Reverse Transkriptase (human
telomerase reverse transcriptase; hTERT)
transfiziert. Die Differenzierung sowie die Proliferation transfizierter (1) und nicht-transfizierter (2) adulter kaniner Glia wurde mit dem Ziel untersucht, mögliche transfektionsabhängige Änderungen des Phänotyps zu
beschreiben und darüber hinaus für die spätere therapeutische Anwendung
wichtige Spezies-spezifische Eigenschaften zu identifizieren. Schließlich
wurden Schwann-Zellen und OECs
mit verschiedenen Staupevirusstämmen in
vitro inkubiert und
die Empfänglichkeit sowie Differenzierung analysiert (3).
(1) Schwann-Zellen
und OECs wurden durch hTERT
Transfektion immortalisiert.
Unbegrenztes Wachstum beider Zelltypen wurde jedoch nur in Gegenwart des
Fibroblastenwachstumsfaktors-2 (fibroblast
growth factor-2; FGF-2) beobachtet. Interessanterweise,
konnten gegensätzlich Effekte von hTERT bezüglich
des in vitro
Wachstums festgestellt werden. Während beider Transfektion
von Schwann-Zellen und OECs
höherer Passagen eine FGF-2 abhängigen Immortalisierung
beobachtet wurde, kam es bei Verwendung der gleichen Zellen aus niedriger
Passage zu einer FGF-2-unabhängigen Reduktion der Proliferation.
Die immortalisierten Zellen zeigten eine geringgradige Änderung ihres molekularen Phänotyps.
Während der Neurotrophinrezeptor p75 (p75NTR), GFAP, p53 und p16 unverändert exprimiert wurden, konnten signifikante Unterschiede bei
der Expression von O4 und A2B5 beobachtet werden. Es ist festzuhalten, dass
die hTERT Transfektions-vermittelte
Immortalisierung glialer
Zellen ein viel versprechender Ansatz zur Etablierung einer stabilen Quelle regenerationsfördernder Gliazellen
dastellt, und, dass hTERT
abhängig vom replikativen „Alter“ der
kultivierten Zellen eine unterschiedliche funktionelle Bedeutung besitzt.
(2) Nicht-transfizierte
kanine Schwann-Zellen und
OECs wurden bezüglich ihrer Langzeit-Proliferation
und antigener Expression vergleichend analysiert.
Beide glialen Zellpopulationen wurden in ihrer Proliferation durch FGF-2 und Heregulin-1ß stimuliert und
exprimierten die Oberflächenmarker p75NTR,
O4 und A2B5 in vergleichbarer Art und Weise. Überraschenderweise proliferierten beide Zelltypen in Langzeit-Kultur ohne
die Zugabe von FGF-2 und Heregulin-1ß und zelluläre Seneszenz wurde erst nach
drei Monaten beobachtet. Die Expression von p75NTR war während
dieses Zeitraums konstant und weder Schwann-Zellen
noch OECs zeigten eine Beschleunigung des Wachstums
nach Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration
durch Forskolin. Diese Eigenschaften kaniner Glia unterscheiden sich
deutlich von denen der Ratte und sind
eindrucksvoller Beleg für ausgeprägte Spezies-spezifische Eigenschaften
beider Zelltypen. Die Tatsache, dass OECs des
Primaten ähnliche Eigenschaften besitzen, unterstreicht die Bedeutung des adulten Hunds als ein translationales
Modell auf dem Weg zur klinischen Anwendung von Schwann-Zellen
und OECs beim Menschen.
(3) Adulte kanine Schwann-Zellen und OECs wurden erfolgreich mit verschiedenen attenuierten und einem virulenten Staupevirusstamm
infiziert. Während keine Unterschiede in der Anzahl infizierter Zellen
zwischen den attenuierten und dem virulenten Stamm
beobachtet wurden, infizierten die einzelnen Stämme Schwann-Zellen
und OECs in unterschiedlicher Art und Weise. Die
Stämme CDV-2544, CDV-OndeGFP und CDV-5804PeGFP
infizierten überwiegend OECs, während der CDV-Ond Stamm sich hauptsächlich in Schwann-Zellen
replizierte. Diese Daten belegen zum ersten Mal die Empfänglichkeit von OECs und Schwann-Zellen für das
Staupevirus in vitro.
Da p75NTR als ein Rezeptor für das neurotrope
Tollwutvirus identifiziert wurde, könnte es interessant sein, den
Zusammenhang zwischen p75NTR –Expression in Schwann-Zellen und OECs und dem
Eintritt des Staupevirus in die Zelle zu untersuchen. Zukünftige
Untersuchungen müssen klären inwieweit OECs eine
wichtige Rolle bei der Staupevirus-Infektion in vivo spielen. Die Tatsache, dass Schwann-Zellen
und OECs eine unterschiedliche Empfänglichkeit
gegenüber den einzelnen Staupevirusstämmen zeigen, ist ein wichtiger
indirekter Hinweis für molekulare Unterschiede zwischen beiden Zelltypen.
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abstract (englisch)
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A variety of studies have shown that Schwann cells
and olfactory ensheathing cells (OECs) are closely related
glial cell types that promote axonal growth and remyelination in vivo following transplantation into the lesioned nervous system. However, the vast majority of
these studies have been done using the rodent model and it is not clear in
how far the data can be extrapolated to large animals and humans. Canine
distemper virus (CDV) infection of
adult dogs is considered an alternative animal model to study demyelinating diseases, including multiple sclerosis.
Recently, it was shown that CDV can enter the brain via infection of
olfactory neurons. Whether associated OECs or Schwann
cells of the peripheral nerve are natural targets for CDV infection has not
been reported so far. Based on these considerations, Schwann cells and OECs were transfected with ectopic human telomerase reverse transcriptase (hTERT) to induce
immortalization thereby establishing a stable source of regenerative adult
canine glial cells. The proliferation and
differentiation of transfected (1) and non-transfected adult canine glia (2) was
analyzed to reveal putative alterations induced by the immortalization
procedure and to characterize species-specific properties of non-transfected glia. Finally,
Schwann cells and OECs were exposed to different
CDV strains in order to study the susceptibility of both cell types to CDV
infection in vitro (3).
(1) Both Schwann cells and OECs
were successfully immortalized by hTERT transfection. However, both transfected
cell types only displayed infinite growth in the presence of fibroblast
growth factor-2 (FGF-2).
Interestingly, adverse effects on cellular growth following hTERT transfection were
observed. Though transfection of late passage
Schwann cells and OECs induced FGF-2-dependent
immortalization, transfection of early passage
cells reduced proliferation independent of FGF-2. Immortalization was
associated with subtle differences in the expression profile. Whereas the
expression of p75 neurotrophin receptor (p75NTR), GFAP, p53, and p16 was unaltered, there
were significant changes in the expression of O4 and A2B5. It is concluded
that hTERT transfection
is an efficient mean for establishing a stable source of adult canine glial cells and that hTERT
plays distinct functional roles depending on the replicative
age of the cultured cells.
(2) Adult canine non-transfected
Schwann cells and OECs were analyzed regarding long-term
proliferation, growth factor responses and antigenic expression. Both glial cell types increased proliferation in response to
the same growth factors, including FGF-2 and heregulin-1ß, and displayed a
similar expression of cell surface markers, such as p75NTR, O4 and A2B5. This
underscored the assumption that both cell types are closely related to each
other. Surprisingly, canine Schwann cells and OECs
maintained long-term proliferation both under serum-containing and serum-free
medium in the absence of any exogenous mitogens and
underwent cellular senescence not until three months in culture. Expression
of p75NTR was constantly observed during the cultivation period and neither
Schwann cells nor OECs increased proliferation
after elevation of the intracellular cAMP level
using forskolin. These characteristics are in
striking contrast to the rodent model and imply pronounced species-specific
properties of both glial cell types. The fact that
there is a similar in vitro growth behaviour of primate OECs
further illustrates the suitability of the adult dog as a translational model
system towards clinical application of regeneration-promoting glia in humans.
(3) Adult canine Schwann cells and OECs could be infected with several attenuated and one
virulent CDV strain. While there were no differences in the infection rate
between the attenuated and the virulent strain, distinct percentages of glial cells were infected by the different viruses.
Whereas OECs were predominantly infected by
CDV-2544, CDV-OndeGFP and CDV-5804PeGFP, the CDV-Ond strain mainly targeted Schwann cells. This is the
first demonstration that Schwann cells and OECs are
susceptible to CDV infection in vitro. Since p75NTR has been shown to
function as a non-essential receptor for the neurotropic
rabies virus, it might be interesting to study its role during CDV infection.
Future investigations, therefore, have to reveal possible relations between
susceptibility to CDV infection and expression levels of p75NTR. However, it
remains to be clarified whether OECs play a pivotal
role during CDV infection in situ. The observation that Schwann cells and OECs displayed distinct susceptibility to CDV is evidence
for substantial differences of both cell types at the molecular level.
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keywords
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Schwann-Zellen, olfaktorische Hüllzellen, Staupevirus; Schwann cells, olfactory ensheathing cells, canine distemper virus
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