Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Somporn Techangamsuwan

 

Immortalization and proliferation of adult canine Schwann cells and olfactory ensheathing cells

and their infection with canine distemper virus

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-97343

title (ger.)

Immortalisierung und Proliferation von adulten kaninen Schwann-Zellen und olfaktorischen Hüllzellen und ihre Infektion mit dem Staupevirus

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2009

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/techangamsuwans_ss09.pdf

abstract (deutsch)

Eine Vielzahl von Studien belegen, dass Schwann-Zellen und olfaktorische Hüllzellen (olfactory ensheathing cells; OECs) eng verwandt sind und axonales Wachstum und Remyelinisierung nach Transplantation in das verletzte Nervensystem fördern. Da bislang fast ausschließlich das Nagermodell untersucht wurde, ist unklar, inwiefern die Daten auf den Menschen übertragbar sind. Die Staupevirus (canine distemper virus; CDV) Infektion adulter Hunde ist ein alternatives Tiermodell zum Studium demyelinisierender Erkrankungen wie z.B. der Multiplen Sklerose. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass CDV über die Infektion olfaktorischer Neurone in das Gehirn eintreten kann. Inwieweit OECs und die Schwann-Zellen des peripheren Nervs natürliche Ziele für das Staupevirus darstellen, ist unklar.

Auf der Grundlage dieser Daten wurden Schwann-Zellen und OECs in der vorliegenden Arbeit zum Zwecke der Immortalisierung und Etablierung einer stabilen Quelle regenerationsfördernder Gliazellen mit ektoper humaner Telomerase Reverse Transkriptase (human telomerase reverse transcriptase; hTERT) transfiziert. Die Differenzierung sowie die Proliferation transfizierter (1) und nicht-transfizierter (2) adulter kaniner Glia wurde mit dem Ziel untersucht, mögliche transfektionsabhängige Änderungen des Phänotyps zu beschreiben und darüber hinaus für die spätere therapeutische Anwendung wichtige Spezies-spezifische Eigenschaften zu identifizieren. Schließlich wurden Schwann-Zellen und OECs mit verschiedenen Staupevirusstämmen in vitro inkubiert und die Empfänglichkeit sowie Differenzierung analysiert (3).

 

(1) Schwann-Zellen und OECs wurden durch hTERT Transfektion immortalisiert. Unbegrenztes Wachstum beider Zelltypen wurde jedoch nur in Gegenwart des Fibroblastenwachstumsfaktors-2 (fibroblast growth factor-2; FGF-2) beobachtet. Interessanterweise, konnten gegensätzlich Effekte von hTERT bezüglich des in vitro Wachstums festgestellt werden. Während beider Transfektion von Schwann-Zellen und OECs höherer Passagen eine FGF-2 abhängigen Immortalisierung beobachtet wurde, kam es bei Verwendung der gleichen Zellen aus niedriger Passage zu einer FGF-2-unabhängigen Reduktion der Proliferation. Die immortalisierten Zellen zeigten eine geringgradige Änderung ihres molekularen Phänotyps. Während der Neurotrophinrezeptor p75 (p75NTR), GFAP, p53 und p16 unverändert exprimiert wurden, konnten signifikante Unterschiede bei der Expression von O4 und A2B5 beobachtet werden. Es ist festzuhalten, dass die hTERT Transfektions-vermittelte Immortalisierung glialer Zellen ein viel versprechender Ansatz zur Etablierung einer stabilen Quelle regenerationsfördernder Gliazellen dastellt, und, dass hTERT abhängig vom replikativen „Alter“ der kultivierten Zellen eine unterschiedliche funktionelle Bedeutung besitzt.

 

(2) Nicht-transfizierte kanine Schwann-Zellen und OECs wurden bezüglich ihrer Langzeit-Proliferation und antigener Expression vergleichend analysiert. Beide glialen Zellpopulationen wurden in ihrer Proliferation durch FGF-2 und Heregulin-1ß stimuliert und exprimierten die Oberflächenmarker p75NTR, O4 und A2B5 in vergleichbarer Art und Weise. Überraschenderweise proliferierten beide Zelltypen in Langzeit-Kultur ohne die Zugabe von FGF-2 und Heregulin-1ß und zelluläre Seneszenz wurde erst nach drei Monaten beobachtet. Die Expression von p75NTR war während dieses Zeitraums konstant und weder Schwann-Zellen noch OECs zeigten eine Beschleunigung des Wachstums nach Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration durch Forskolin. Diese Eigenschaften kaniner Glia unterscheiden sich deutlich von denen der  Ratte und sind eindrucksvoller Beleg für ausgeprägte Spezies-spezifische Eigenschaften beider Zelltypen. Die Tatsache, dass OECs des Primaten ähnliche Eigenschaften besitzen, unterstreicht die Bedeutung des adulten Hunds als ein translationales Modell auf dem Weg zur klinischen Anwendung von Schwann-Zellen und OECs beim Menschen.

 

(3) Adulte kanine Schwann-Zellen und OECs wurden erfolgreich mit verschiedenen attenuierten und einem virulenten Staupevirusstamm infiziert. Während keine Unterschiede in der Anzahl infizierter Zellen zwischen den attenuierten und dem virulenten Stamm beobachtet wurden, infizierten die einzelnen Stämme Schwann-Zellen und OECs in unterschiedlicher Art und Weise. Die Stämme CDV-2544, CDV-OndeGFP und CDV-5804PeGFP infizierten überwiegend OECs, während der CDV-Ond Stamm sich hauptsächlich in Schwann-Zellen replizierte. Diese Daten belegen zum ersten Mal die Empfänglichkeit von OECs und Schwann-Zellen für das Staupevirus in vitro. Da p75NTR als ein Rezeptor für das neurotrope Tollwutvirus identifiziert wurde, könnte es interessant sein, den Zusammenhang zwischen p75NTR –Expression in Schwann-Zellen und OECs und dem Eintritt des Staupevirus in die Zelle zu untersuchen. Zukünftige Untersuchungen müssen klären inwieweit OECs eine wichtige Rolle bei der Staupevirus-Infektion in vivo spielen. Die Tatsache, dass Schwann-Zellen und OECs eine unterschiedliche Empfänglichkeit gegenüber den einzelnen Staupevirusstämmen zeigen, ist ein wichtiger indirekter Hinweis für molekulare Unterschiede zwischen beiden Zelltypen.

 

abstract (englisch)

A variety of studies have shown that Schwann cells and olfactory ensheathing cells (OECs) are closely related glial cell types that promote axonal growth and remyelination in vivo following transplantation into the lesioned nervous system. However, the vast majority of these studies have been done using the rodent model and it is not clear in how far the data can be extrapolated to large animals and humans. Canine distemper virus (CDV) infection of adult dogs is considered an alternative animal model to study demyelinating diseases, including multiple sclerosis. Recently, it was shown that CDV can enter the brain via infection of olfactory neurons. Whether associated OECs or Schwann cells of the peripheral nerve are natural targets for CDV infection has not been reported so far. Based on these considerations, Schwann cells and OECs were transfected with ectopic human telomerase reverse transcriptase (hTERT) to induce immortalization thereby establishing a stable source of regenerative adult canine glial cells. The proliferation and differentiation of transfected (1) and non-transfected adult canine glia (2) was analyzed to reveal putative alterations induced by the immortalization procedure and to characterize species-specific properties of non-transfected glia. Finally, Schwann cells and OECs were exposed to different CDV strains in order to study the susceptibility of both cell types to CDV infection in vitro (3).

 

(1) Both Schwann cells and OECs were successfully immortalized by hTERT transfection. However, both transfected cell types only displayed infinite growth in the presence of fibroblast growth factor-2 (FGF-2). Interestingly, adverse effects on cellular growth following hTERT transfection were observed. Though transfection of late passage Schwann cells and OECs induced FGF-2-dependent immortalization, transfection of early passage cells reduced proliferation independent of FGF-2. Immortalization was associated with subtle differences in the expression profile. Whereas the expression of p75 neurotrophin receptor (p75NTR), GFAP, p53, and p16 was unaltered, there were significant changes in the expression of O4 and A2B5. It is concluded that hTERT transfection is an efficient mean for establishing a stable source of adult canine glial cells and that hTERT plays distinct functional roles depending on the replicative age of the cultured cells.

 

(2) Adult canine non-transfected Schwann cells and OECs were analyzed regarding long-term proliferation, growth factor responses and antigenic expression. Both glial cell types increased proliferation in response to the same growth factors, including FGF-2 and heregulin-1ß, and displayed a similar expression of cell surface markers, such as p75NTR, O4 and A2B5. This underscored the assumption that both cell types are closely related to each other. Surprisingly, canine Schwann cells and OECs maintained long-term proliferation both under serum-containing and serum-free medium in the absence of any exogenous mitogens and underwent cellular senescence not until three months in culture. Expression of p75NTR was constantly observed during the cultivation period and neither Schwann cells nor OECs increased proliferation after elevation of the intracellular cAMP level using forskolin. These characteristics are in striking contrast to the rodent model and imply pronounced species-specific properties of both glial cell types. The fact that there is a similar in vitro growth behaviour of primate OECs further illustrates the suitability of the adult dog as a translational model system towards clinical application of regeneration-promoting glia in humans.

 

(3) Adult canine Schwann cells and OECs could be infected with several attenuated and one virulent CDV strain. While there were no differences in the infection rate between the attenuated and the virulent strain, distinct percentages of glial cells were infected by the different viruses. Whereas OECs were predominantly infected by CDV-2544, CDV-OndeGFP and CDV-5804PeGFP, the CDV-Ond strain mainly targeted Schwann cells. This is the first demonstration that Schwann cells and OECs are susceptible to CDV infection in vitro. Since p75NTR has been shown to function as a non-essential receptor for the neurotropic rabies virus, it might be interesting to study its role during CDV infection. Future investigations, therefore, have to reveal possible relations between susceptibility to CDV infection and expression levels of p75NTR. However, it remains to be clarified whether OECs play a pivotal role during CDV infection in situ. The observation that Schwann cells and OECs displayed distinct susceptibility to CDV is evidence for substantial differences of both cell types at the molecular level.

 

keywords

Schwann-Zellen, olfaktorische Hüllzellen, Staupevirus; Schwann cells, olfactory ensheathing cells, canine distemper virus

kb

4.131