Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Karen Beatrix Tappenbeck

 

Lidocaine effects in equine jejunal circular and longitudinal smooth muscle in vitro

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104427

title (ger.)

Wirkungen von Lidocain an der glatten Zirkulär- und Longitudinalmuskulatur des equinen Jejunums in vitro

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/tappenbeckk_ws13.pdf

abstract (deutsch)

Bei Pferden, die Operationen am Gastrointestinaltrakt unterzogen werden, tritt häufig postoperativer Ileus (POI) als schwerwiegende Komplikation auf, insbesondere nach Läsionen im Bereich des Dünndarms (ROUSSEL et al. 2001). Für POI wurden Inzidenzraten von 10-19% berichtet (FREEMAN et al. 2000; ROUSSEL et al. 2001; COHEN et al. 2004), verbunden mit Todesraten von bis zu 86% (HUNT et al. 1986). Der POI ist charakterisiert durch eine reduzierte propulsive Darmmotilität und geht klinisch einher mit abdominalem Schmerz, fehlenden Darmgeräuschen, fehlendem Kot- und Urinabsatz, Flüssigkeitsakkumulation in Magen und Dünndarm, die in nasogastralen Reflux resultiert, Änderungen in der Farbe der Maulschleimhaut, verlängerter kapillärer Füllungszeit und gesteigerter Pulsfrequenz (HUNT et al. 1986). Für die Behandlung des POI bei Pferden ist Lidocain, ein Lokalanästhetikum (LÖSCHER 2006) und Klasse IB-Antiarrhythmikum (UNGEMACH 2006), das zurzeit am häufigsten eingesetzte Medikament (VAN HOOGMOED et al. 2004), obwohl sein prokinetischer Wirkmechanismus bisher noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass Lidocain die Kontraktilität der glatten Darmmuskulatur in vitro konzentrationsabhängig steigerte (GUSCHLBAUER et al. 2010a). Ziel des vorliegenden PhD-Projektes war es daher, die Wirksamkeit von Lidocain im Hinblick auf eine Kontraktilitätssteigerung an der equinen Darmmuskulatur in vitro näher zu untersuchen und dabei auf mögliche Mechanismen rückzuschließen, die den beobachteten Effekten zugrunde liegen könnten. Zu diesem Zweck wurden glatte Muskelstreifen aus dem equinen Jejunum präpariert und in vitro mit Lidocain behandelt.

Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die kontraktilitätssteigernde Wirkung des Lidocains aus seiner Einlagerung in Zellmembranen glatter Muskelzellen mit nachfolgenden Änderungen der Zellmembraneigenschaften resultiert, moduliert durch seine molekulare Struktur und Lipophilie.  Es wurde vorgeschlagen, dass der Einfluss des Lidocains auf die Zellmembraneigenschaften eine Verbesserung der Zellmembranintegrität beinhaltet, erfassbar durch eine reduzierte Freisetzung von Kreatinkinase (CK) aus den glatten Muskelzellen (GUSCHLBAUER et al. 2010a). Um den Einfluss der molekularen Struktur und Lipophilie des Lidocains auf die Kontraktilität der glatten Muskulatur und auf die Kreatinkinasefreisetzung beurteilen zu können, wurden die in vitro-Effekte von Lidocain mit der Wirkung von vier anderen, strukturverwandten Substanzen verglichen, namentlich Mexiletin, Bupivacain, Tetracain und Procain. Es konnte gezeigt werden, dass alle Substanzen an der glatten Muskulatur eine konzentrationsabhängige Kontraktilitätssteigerung bewirkten, gefolgt von einer Abnahme in der Kontraktilität bei hohen Substanzkonzentrationen. Trotzdem unterschied sich der Verlauf der kontraktilitätssteigernden Effekte zwischen den verschiedenen Substanzen. Nur das mit dem Lidocain strukturell eng verwandte Mexiletin rief eine dem Lidocain ähnliche kontraktilitätssteigernde Wirkung hervor und reduzierte wie Lidocain die CK-Freisetzung aus der glatten Muskulatur. Aus diesem Grund wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass Lidocain und Mexiletin mit Zellmembranen glatter Muskelzellen interagieren könnten, wobei ihre ähnlichen Wirkungen mutmaßlich aus ihrer Ähnlichkeit bezüglich Struktur und Lipophilie resultierten.

Um den Einfluss von Lidocain auf die Eigenschaften von Zellmembranen näher zu untersuchen, wurde eine zweite Studie durchgeführt, die sich mit der Wirkung von Lidocain auf Detergenzien-resistente Mikrodomänen in Zellmembranen (DRMs) der equinen Darmmuskulatur befasste. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass Lidocain DRMs in glatten Muskelzellen und/oder interstitiellen Zellen nach Cajal (ICC) zerstört. Es wurde gezeigt, dass Lidocain eine Umverteilung des DRM-Markerproteins Flotillin-2 in Fraktionen von Saccharosedichtegradienten verursachte, was auf eine Zerstörung von DRMs hindeutete. Da gezeigt wurde, dass die Zerstörung von DRMs die Aktivität von membranständigen Ionenkanälen veränderte, wie von PRISTERA und OKUSE (2012) zusammengefasst, wurde vorgeschlagen, dass der Lidocain-induzierte Anstieg in der Kontraktilität der glatten Muskulatur auf Zerstörung von DRMs und nachfolgenden Änderungen in zellulären Ionenströmen basieren könnte.

Bislang haben sich Studien zur kontraktilitätsteigernden Wirkung von Lidocain auf die glatte Ringmuskulatur konzentriert (GUSCHLBAUER et al. 2010a, 2011; Studie 1). Aus diesem Grund wurde im Zuge des vorliegenden PhD-Projektes eine dritte Studie durchgeführt mit dem Ziel, die Wirkungen von Lidocain auf die glatte Ring- und Längsmuskulatur zu vergleichen, da beide Muskelschichten zur physiologischen Motilität des Darms beitragen. Als Ergebnis steigerte Lidocain konzentrationsabhängig die Kontraktilität sowohl in der Ring- als auch in der Längsmuskulatur, wobei aber in der Längsmuskulatur höhere Konzentrationen erforderlich waren um einen signifikanten Effekt hervorzurufen. Hohe Lidocainkonzentrationen bewirkten eine Abnahme in der Kontraktilität der Ringmuskulatur in Übereinstimmung mit früheren Studien (GUSCHLBAUER et al. 2010a; Studie 1), induzierten aber kein Absinken in der Kontraktilität der Längsmuskulatur. In der Literatur gibt es Hinweise darauf, dass in den Eigenschaften von Ring- und Längsmuskelzellen Unterschiede bestehen (MURTHY et al. 1991; LIU u. HUIZINGA 1993; KUEMMERLE et al. 1994; MCKIRDY et al. 2004). Folglich wurde vorgeschlagen, dass Unterschiede in der Lidocainwirkung an der Ring- und Längsmuskulatur aus diesen Unterschieden in den molekularen Eigenschaften resultieren könnten.

Obgleich das enterische Nervensystem (ENS) für die Kontrolle der Darmmotilität eine wichtige Rolle spielt, wurden bisherige in vitro-Studien an glatter Darmmuskulatur durchgeführt, in der das ENS durch Tetrodotoxin (TTX) deaktiviert war, um Lidocaineffekte auf die intrinsische Kontraktilität der glatten Muskulatur zu bestimmen (GUSCHLBAUER et al. 2010a, 2011; Studien 1, 3). Aus diesem Grund wurde eine vierte Studie durchgeführt, um die kontraktilitätssteigernde Wirkung von Lidocain an glatter Muskulatur in der An- und Abwesenheit von TTX zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass der Anstieg in der Kontraktilität der Ring- und Längsmuskulatur bei niedrigen und mittleren Lidocainkonzentrationen nicht durch Zugabe von TTX beeinflusst wurde, ebenso wie die Abnahme in der Kontraktilität der Ringmuskulatur bei hohen Lidocainkonzentrationen. Die Aktivität des ENS wurde durch hohe Lidocainkonzentrationen sowohl in der Ring- als auch in der Längsmuskulatur reduziert. Es wurde geschlussfolgert, dass Lidocain die Kontraktilität der glatten Muskulatur durch direkte Wirkung an den glatten Muskelzellen und/oder ICC zu steigern scheint, unabhängig von der Aktivität des ENS. In vivo könnten sich hohe Lidocainkonzentrationen nachteilig auf die Darmmotilität auswirken, durch eine Herabsetzung der Kontraktilität der glatten Ringmuskulatur und der Aktivität des ENS.

Trotz der Tatsache, dass die kontraktilitätssteigernde Wirkung von Lidocain in vitro  verlässlich reproduzierbar war, bleibt die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf in vivo-Situationen begrenzt, da das Medikament unter den in vitro-Bedingungen nicht metabolisiert wurde und keine systemischen Effekte erfasst werden konnten. Des Weiteren überstiegen die Lidocainkonzentrationen, die in vitro eine Kontraktilitätssteigerung an der glatten Muskulatur hervorriefen, bei Weitem die therapeutischen Konzentrationen im Blut nach in vivo-Infusion von Lidocain (MALONE et al. 2006). Da die ermittelten Ergebnisse eine Wirkung von Lidocain über seine Einlagerung in die Zellmembranen glatter Muskelzellen und/oder ICC suggerierten, wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese Einlagerung mit einer Lidocainakkumulation in der Darmwand einhergehen könnte. Infolgedessen wurde spekuliert, dass eine solche Lidocainakkumulation höhere Gewebs- im Vergleich zu den Plasmakonzentrationen hervorrufen könnte, die im Bereich der in vitro wirksamen Lidocainkonzentrationen liegen könnten – eine Hypothese, die durch weitere pharmakologische Studien evaluiert werden muss.

 

abstract (englisch)

In horses which undergo gastrointestinal surgery, postoperative ileus (POI) frequently occurs as a severe complication especially following small intestinal lesions (ROUSSEL et al. 2001). For POI, incidence rates of 10-19% were reported (FREEMAN et al. 2000; ROUSSEL et al. 2001; COHEN et al. 2004) combined with death rates of up to 86% (HUNT et al. 1986). POI is characterised by a reduced propulsive motility of the intestine, clinically accompanied by abdominal pain, missing of gastrointestinal sounds, a deficiency in defaecation and urination, accumulation of fluid in the stomach and small intestine resulting in nasogastric reflux, changes in the mucous membrane colour, prolonged capillary refill time and elevated pulse rates (HUNT et al. 1986). For treating POI in horses, lidocaine, a local anaesthetic (LÖSCHER 2006) and class IB antiarrhythmic agent (UNGEMACH 2006), currently is the most frequently applied drug (VAN HOOGMOED et al. 2004), although its prokinetic mechanism of action has not been finally elucidated. Previous studies demonstrated that lidocaine concentration-dependently increased the intestinal smooth muscle (SM) contractility in vitro (GUSCHLBAUER et al. 2010a). Therefore aim of the present PhD project was to further examine the efficacy of lidocaine for increasing the contractility of equine intestinal SM in vitro and thereby to assess possible mechanisms underlying the observed effects. For this purpose, equine jejunal SM strips were prepared and treated with lidocaine in vitro.

It was hypothesised that the contractility-enhancing effects of lidocaine resulted from its insertion into cell membranes of SM cells and consecutive alterations of cell membrane properties, modulated by its molecular structure and lipophilicity. The impact of lidocaine on cell membrane properties was suggested to include improved cell membrane integrity, assessed by a reduced release of creatine kinase (CK) from SM cells (GUSCHLBAUER et al. 2010a). In order to determine the influence of lidocaine’s molecular structure and lipophilicity on SM contractility and CK release, in vitro effects of lidocaine were compared to the effects of four other, structurally related substances, namely mexiletine, bupivacaine, tetracaine and procaine. It was shown that all substances concentration-dependently increased the SM contractility, followed by a decrease in contractility at high concentrations. However, the course of contractility-enhancing effects differed between the different substances. Only mexiletine, which is structurally closely related to lidocaine, provided contractility-enhancing effects similar to lidocaine and like lidocaine reduced the CK release from SM. For this reason it was concluded that lidocaine and mexiletine may interact with SM cell membranes with comparable effects presumably resulting from their structural and lipophilic similarity.

In order to further examine the impact of lidocaine on cell membrane properties, a second study was performed regarding effects of lidocaine on detergent-resistant membrane microdomains (DRMs) in equine intestinal SM. It was hypothesised that lidocaine disrupts DRMs in SM cells and/or interstitial cells of Cajal (ICC). Lidocaine was found to cause redistribution of the DRM marker protein flotillin-2 in fractions of sucrose density-gradients, indicating DRM disruption. As DRM disruption was shown to alter activity of membrane ion channels as summarised by PRISTERA and OKUSE (2012), it was suggested that the lidocaine-induced increase in SM contractility might be based on DRM disruption and subsequent changes in cellular ion fluxes.

So far, studies regarding contractility-enhancing effects of lidocaine focussed on the circular SM (CSM) layer (GUSCHLBAUER et al. 2010a, 2011; Study 1). Therefore, the third study conducted during the present PhD project aimed to compare lidocaine effects on the contractility of CSM and longitudinal SM (LSM) of equine small intestine as both SM layers contribute to the physiological intestinal motility. As a result, lidocaine concentration-dependently increased the contractility in both CSM and LSM, but higher lidocaine concentrations were required for provoking significant effects in LSM. High lidocaine concentrations caused a decrease in CSM contractility in accordance with previous studies (GUSCHLBAUER et al. 2010a; Study 1) but did not induce a decline in LSM contractility. Data in literature suggested differences in characteristics of CSM and LSM cells (MURTHY et al. 1991; LIU and HUIZINGA 1993; KUEMMERLE et al. 1994; MCKIRDY et al. 2004). Consequently, it was suggested that differences in lidocaine effects on CSM and LSM might result from these differences in molecular characteristics.

Although the enteric nervous system (ENS) takes major part in controlling intestinal motility, so far recent in vitro studies were performed in intestinal SM in which the ENS was deactivated using tetrodotoxin (TTX) in order to determine lidocaine effects on intrinsic SM contractility (GUSCHLBAUER et al. 2010a, 2011; Studies 1, 3). Therefore, a fourth study was conducted comparing contractility-enhancing effects of lidocaine in SM in the presence and absence of TTX. Obtained results illustrated that the increase in CSM and LSM contractility at low to medium-ranged lidocaine concentrations was not altered by TTX application, as well as the decrease in CSM contractility at high lidocaine concentrations. The activity of the ENS was reduced at high lidocaine concentrations in both CSM and LSM. In conclusion, lidocaine seemed to increase the SM contractility by directly affecting SM cells and/or ICC independent from ENS activity. In vivo, high lidocaine concentrations might induce adverse effects on intestinal motility due to decreased CSM contractility and ENS activity.

Despite the fact that the contractility-enhancing effects of lidocaine were reliably reproducible in vitro, the applicability of the observed results to in vivo situations remains limited due to missing drug metabolism and lack of systemic effects under in vitro conditions. Furthermore, lidocaine concentrations which increased the SM contractility in vitro significantly exceeded therapeutic blood concentrations following in vivo infusion of lidocaine (MALONE et al. 2006). As the obtained results suggested a mechanism of action based on the insertion of lidocaine into cell membranes of SM cells and/or ICC, it was hypothesised that this insertion might be associated with lidocaine accumulation within the intestinal wall. Hence it was speculated that lidocaine accumulation might result in higher tissue compared to plasma concentrations, corresponding to effective lidocaine concentrations in vitro - a hypothesis which needs to be evaluated in further pharmacological studies.

 

keywords

Lidocain, Kontraktilität, Equines Jejunum, Lidokanie, Contractility, Equine jejunum

kb

13.812