Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Thirumala Rao Talluri

APPROACHES FOR THE DERIVATION OF INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS FROM CATTLE

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106010

title (engl.)

ANSÄTZE ZUR ABLEITUNG VON INDUZIERTEN PLURIPOTENTEN STAMMZELLEN VOM RIND

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/tallurit_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Pluripotenz beschreibt die Fähigkeit von Stammzellen sich in jede Körperzelle zu entwickeln. Die direkte Reprogrammierung somatischer Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) konnte durch ektopische Expression von Kombinationen definierter Reprogrammierungsfaktoren, wie Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog und Lin28 im Mausmodell und in anderen Spezies erreicht werden. Die erhaltenen murinen iPS-Zellen stehen morphologisch und funktionell den embryonalen Stammzellen (ES) nahe, und können in alle Körperzellen einschließlich der Keimzellen differenzieren. Diese Eigenschaften machen iPS-Zellen zu einem attraktiven Werkzeug für grundlegende und angewandte Forschung in biomedizinischen und biotechnologischen Bereichen. Im Hinblick auf Nutztierspezies verspricht die iPS-Technologie die Verbesserung von Produktions- und Reproduktionseigenschaften.

Der virale Gentransfer der Reprogrammierungsfaktoren gewährleistet eine hohe Transduktionseffizienz, hat aber auch Nachteile, wie i) eine limitierte DNA-Beladung, ii) potentielle Genotoxizität, und iii) Sicherheitsaspekte. In dieser Arbeit untersuchte ich nicht-virale Transposonsysteme für die Reprogrammierung boviner somatischer Zellen zu iPS-Zellen. Ich verglich die piggyBac (PB) und Sleeping Beauty (SB) Systeme, und nutzte unterschiedliche Kombinationen von Reprogrammierungsfaktoren. Vorteile der Transposon-System sind i) geringe Kosten, ii) wesentlich größere DNA-Beladung, iii) keine Sicherheitsbedenken (Transposons sind nicht-infektiös), und iv) die potentielle nahtlose Entfernung aus dem Genom.

Zuerst wurde die Eignung der Transposon-Systeme für die zelluläre Reprogrammierung im gutdefinierten Mausmodell untersucht. Dann wurde die Eignung von Transposon-iPS-Zellen für die gerichtete Differenzierung in einen terminal differenzierten Zelltyp studiert. Schließlich wurden bovine iPS-Zellen mit den optimierten Transposon-Konditionen generiert.

Zunächst wurden die PB und SB Transposon-Systeme für die Ableitung von iPS-Zellen aus Inzucht (BL/6) und Auszucht (NMRI)-Mauslinien getestet. Die BL/6-Mausfibroblasten trugen einen Pluripotenzreporter, Oct4-EGFP, der es erlaubte die Reprogrammierung durch Vital-Fluoreszenzmikroskopie zu verfolgen. Das PB-Reprogrammierungstransposon kodierte die cDNAs der OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 und NANOG Reprogrammierungsfaktoren, jeweils durch selbstschneidende Peptid-Sequenzen getrennt und unter transkriptioneller Kontrolle des chimären CAGGS-Promoters. Das SB-Transposon kodierte die gleichen Faktoren, aber ohne NANOG und LIN28. Beide Transposon-System resultierten in der erfolgreichen Generierung muriner iPS-Zell-Linien. Die Reduktion der Faktoren auf den PB-Transposon, um das Proto-Onkogen c-MYC zu entfernen, erlaubte die iPS-Zell-Ableitung allerdings mit verringerter Effizienz. Für die gezielte Differenzierung muriner iPS-Zellen wurde ein Mausmodell mit Linsenzell-spezifischer Expression des fluoreszenten Reporterproteins tdTomato erstellt. Induzierte PS-Zellen dieser Maus wurden mit dem SB-Transposon erstellt, und in vitro zu Linsenkörperchen (lentoid bodies) differenziert. Die Expression des Reporterproteins erlaubt es das Wachsen der Linsenkörperchen in vitro zu verfolgen.

Optimierte Bedingungen der Transposon-Reprogrammierung wurden dann für die Ableitung boviner iPS-Zellen verwendet. Fetale Rinderfibroblasten wurden jeweils mit den SB und PB-Systemen elektroporiert, und in unterschiedlichen Nährmedien kultiviert. Durch die Verwendung des PB-Systems und einer Supplementierung des Nährmediums mit bFGF (8 ng/ml) und hLIF (1000 U/ml) konnte eine stabile Linie, biPS-1, erhalten werden. Die biPS-1-Linie zeigte typische Charakteristika pluripotenter Zellen, einschließlich der Bildung von vollentwickelten Teratomen, und erlaubte weitere genetische Modifikation. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass bovine iPS-Zellen über ein nicht-virales Transposon-System ableitbar sind, offenbar ist die ektopische Expression on NANOG und LIN28 notwendig für die erfolgreiche Reprogrammierung boviner Fibroblasten. Die Ergebnisse sind ein wichtiger Schritt für die routinemäßige Ableitung boviner iPS-Zellen und werden die genetische Modifikation des Rindergenoms vereinfachen.

 

abstract (englisch)

Pluripotency describes the ability of a stem cell to form every cell type of the body. Direct reprogramming of somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has been achieved by forced expression of combinations of defined reprogramming factors, such as Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog and Lin28 in the mouse model and other species. The resulted murine iPS cells are morphologically and functionally similar to embryonic stem (ES) cells and can differentiate into virtually any cell type of the body including germ cells. These features makes iPS cells an attractive tool for basic and applied research in the fields of biomedicine and biotechnology. With regard to livestock species, the iPS technology promises to improve productive and reproductive traits.

Viral methods of gene transfer for reprogramming ensure a high transduction efficiency, but have some disadvantages like i) limited cargo, ii) potential genotoxicity and iii) safety concerns. Here, I assessed a non-viral transposon method for reprogramming of bovine somatic cells to iPS cells. I compared two transposon systems namely, piggyBac (PB) and Sleeping Beauty (SB) employing different combinations of reprogramming factors. Advantages of the transposon systems are i) low costs, ii) larger cargo, iii) no safety concerns (transposons are non-infectious) and iv) potential of seamless removal of transposon cassettes.

The first aim included to test and to compare the suitability of the transposon systems for reprogramming in the well-defined mouse species. Then the suitability of transposon iPS cells for targeted differentiation into a terminally differentiated cell type was assessed. Finally, bovine iPS cells were derived by employing optimized transposon conditions.

Initially the PB and SB transposon systems have been tested for the derivation of iPS cells from cells of inbred (BL6) and outbred (NMRI) mice, respectively. The murine fibroblasts derived from an inbred BL/6 mouse line carrying a pluripotency reporter, Oct4-EGFP, allowed to following reprogramming by fluorescence microscopy. The reprogramming PB transposon encoded the cDNAs of reprogramming factors OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 and NANOG, each separated by self-cleaving peptide sequences and driven by the chimeric CAGGS promoter, whereas SB transposon encoded for the same transcription factors excluding LIN28 and NANOG. Both transposon systems resulted in the successful isolation of murine iPS cell lines. The reduction of the core reprogramming factors to omit the proto-oncogene c-MYC was compatible with iPS cell line derivation, though with reduced reprogramming efficiencies. For targeted differentiation a transgenic mouse model with expression of a vital fluorophore reporter, tdTomato, in the eye lens was exploited. IPS cells from the transgenic mice were generated by SB reprogramming and these iPS cells were differentiated into lentoid bodies in-vitro. The lens-specific reporter allowed fluorescence detection of lens cell differentiation in-vitro.

Finally, the optimized conditions for transposon reprogramming were used to derive bovine iPS (biPS) cells. Fetal fibroblasts were electroporated with SB and PB systems, respectively. Different culture media conditions were tested for maintaining the pluripotent status of biPS cells. By using bFGF (8 ng/ml) and hLIF (1000 U/ml) supplementation a stable bovine iPS culture, biPS-1, could be established by PB reprogramming. The derived biPS line expressed typical endogenous markers of embryonic stem cells, proliferated rapidly, showed long term proliferation and readily formed teratomas. Importantly, additive gene transfer was possible in the biPS-1 line. This study is the first demonstration that biPS cells can be generated by a non-viral transposon system, it suggests that ectopic NANOG and LIN 28 are necessary for reprogramming of bovine cells. These results are a major step towards the routine derivation of biPS cells and will facilitate the genetic modifications of the bovine genome.

 

keywords

Transponson-Reprogrammierung, bovine iPS-Zellen, Stammzellen, transponson reprogramming, bovine IPS cells, stem cells

kb

2.988