Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Patrick Steinig

Langzeiteffekte der Behandlung equiner Melanome und Charakterisierung des Zytokinexpressionsprofils gesunder Pferde

Eine Studie zur Interleukin 12 und 18 Gentherapie in vivo

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110214

title (eng.)

Long-term effects of the treatment of equine melanoma and characterization of the cytokine expression profiles of healthy horses

A study on interleukin-12 and -18 gene therapy in vivo

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/steinigp_ss17.pdf

abstract (deutsch)

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Langzeiteffekte der Behandlung equiner Melanome nach Behandlung mit Genvektoren kodierend für IL-12 und IL-18 aufzuzeigen und Zytokinprofile zur Charakterisierung der Immunantwort bei gesunden Pferden zu erstellen. Die  antitumorale Wirksamkeit von Vektoren kodierend für equines IL-12 und IL-18 wurde bereits in einer Vorläuferstudie klinisch demonstriert. Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um weiteres Verständnis der immunologischen Abläufe zu erlangen.

Es wurden 19 Pferde der Vorläuferstudie 650 Tage nach der letzten Behandlung mit DNA erneut untersucht. Ziel war die Evaluation des Melanomwachstums und die Erfassung unerwünschter Effekte. Insgesamt zeigten die untersuchten Tumore eine Volumenzunahme. Dies weist darauf hin, dass die Tumorremission, die in der Vorgängerstudie beschrieben wurde, als Therapieerfolg zu werten ist, da bei Aussetzen der Therapie das für Melanome typische Wachstum wieder einsetzt.

Die Volumenzunahme in der Langzeitbetrachtung zeigt, dass die behandelten Melanome ohne Behandlung eine Wachstumstendenz besitzen. Dies bedeutet einerseits, dass die in der Vorgängerstudie erzielte Remission als Erfolg zu werten ist und andererseits, dass das Therapiekonzept in Bezug auf die Behandlungsdauer und Frequenz bei einem erneuten Einsatz als Therapeutikum angepasst werden muss.

In einer zweiten klinischen Studie wurde die Zytokinexpression nach einmaliger lokaler und systemischer Behandlung mit MIDGE®-Th1-Vektoren kodierend für equines IL-12 und IL-18 in Kombination mit der Transfektionreagenz SAINT-18 bei 24 gesunden Pferden gemessen. Die Pferde wurden in vier Behandlungsgruppen aufgeteilt, die alle SAINT-18, zum Teil kombiniert mit Vektoren kodierend für IL-12 und IL-18, Vektoren ohne Startcodon oder Vektoren mit invertierten CpG-Motiven behandelt wurden. Zur Ermittlung der Zytokinexpression von IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IL,18, CCL2, CXCL2, CXCL8, CXCL10 und IFNg wurde eine quantitative PCR (SYBR® Green) etabliert. Bei den Untersuchungen zeigte sich eine Zunahme der Expression von IL-18, CXCL10 und CCL2 in der Haut von Pferden, die DNA erhielten. Interessanterweise hatte der Gehalt an CpG-Motiven keinen Einfluss auf die Stärke der gemessenen kurzfristigen Immunantwort. Die kodierenden Vektoren zeigten jedoch die höchste Expression von CXCL10. Daher wurden die kodierenden Vektoren und die doppelsträngige DNA als ursächlich für immunologische Effekte der Therapie ausgemacht.

Auch wenn ein direkter Nachweis der Transfektion nicht erbracht werden konnte, wurde, indirekt in Form des CXCL10-Anstiegs, ein Nachweis der Aktivierung der IL-12/IL-18 Kaskade erbracht.

Die ermittelten Veränderungen in der Zytokinexpression zeigen, dass durch die Vektoren eine proinflammatorische Immunreaktion ausgelöst wird, die ursächlich für den  antitumoralen Effekt sein kann. Daher wäre eine Untersuchung an Pferden mit equinen Melanomen und eine Fokussierung auf die hier dargelegten Immunmechanismen anzustreben.

abstract (englisch)

The present study aimed to demonstrate long-term effects of the treatment with gene expression vectors encoding for IL-12 and IL-18 on equine melanoma. Additionally, cytokine profiles to characterize the immune response to these linear DNA-vectors coding for IL-12 and 18 were assessed in healthy horses. Clinically, the antitumor activity of vectors encoding for equine IL-12 and IL-18 was demonstrated in an earlier study. To elucidate the underlying immunological processes the present study was performed.

First, 19 melanoma-bearing horses of the initial study were re-examined approximately 650 days after the last therapeutic DNA-application to assess melanoma growth and side effects. Overall, the examined tumors were increased in volume. This demonstrates that the tumor remission, which was described in the previous study, was not maintained after cessation of the treatment. No side-effects except for the previously described local depigmentations were recorded.

Second, cytokine expression was measured after a single local and systemic treatment with SAINT-18 formulated (complexed) MIDGE®-Th1-vectors encoding for equine IL-12 and IL-18 in 24 healthy horses. Horses were assigned to four groups, all received SAINT-18. The groups were treated with either complexed IL-12 and IL-18 encoding MIDGE-DNA, complexed nonsense DNA or complexed nonsense DNA without CpG. One Group received the transfection agent SAINT-18 alone. To determine the expression of the cytokines/chemokines, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IL-18, CCL2, CXCL2, CXCL8, CXCL10 and IFNg a quantitative PCR (SYBR® Green) was established and applied. An increase in expression of IL-18, CXCL10 and CCL2 was demonstrated in all DNA receiving groups. Interestingly, the CpG content of the vector did not elevate the response. The immunogenicity of the different vectors was similar comparing the groups. However, the interleukin expressing vectors induced the highest expression of CXCL10 in the skin at the injection site. Hence, double-stranded DNA and the encoded cytokines were identified as main immune stimulants.

Although a direct proof of transfection could not be provided, a detection of the activation of the IL-12/IL-18 cascade was obtained indirectly. The CXCL10-elevation demonstrated served as an indicator of effects of transgene IL-12/IL-18.

In summary, the increase of tumor volumes  displays that the treated melanoma  resume growth without further treatment. This means on the one hand, that the remission reached in the previous study is considered a success attributable to the treatment, and secondly implies, that the therapy concept for the used vectors in relation to the duration and frequency of treatment have to be adapted. The changes in cytokine expression demonstrated in healthy horses treated with IL-12/IL-18 vectors indicate that a pro-inflammatory immune response is triggered by the treatment. This could be causative for the antitumor effect. Therefore, an examination of horses with equine melanomas focusing on the immune mechanisms shown in this study would be desirable.

keywords

Melanom, Pferd, Zytokin ; melanoma, horse, cytokine

kb

7.271