Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Nicole Steffensen

Isolierung, Aufreinigung und Kultivierung kaniner Schwann-Zellen aus Spinalnerven paraplegischer Hunde mit Rückenmarkstrauma

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108574

title (engl.)

Isolation, purification, and cultivation of canine Schwann cells from spinal nerve biopsies of paraplegic dogs with spinal cord injury

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/steffensenn_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Rückenmarkstraumen beim Hund, welche durch externe oder interne Insulte verursacht werden können, führen zu neurologischen Ausfallserscheinungen unterschiedlichen Schweregrades. Bei Patienten mit Plegie und Verlust der Tiefenschmerzwahrnehmung ist die Prognose für eine Wiederherstellung der willkürlichen Motorik trotz chirurgischer Therapie oft ungünstig. Innovative Therapiemöglichkeiten, wie z.B. zellbasierte Transplantationsstrategien, sind daher in den Fokus der medizinischen Forschung gerückt, wobei Schwann-Zellen ein vielversprechendes Potential regenerationsfördernder Eigenschaften aufweisen. Daher stellte das Ziel der vorliegenden Arbeit die Etablierung eines Protokolls zur Isolierung, Aufreinigung und Kultivierung kaniner Schwann-Zellen aus Spinalnervbioptaten dar. Dabei sollte eine ausreichend hohe Gesamtzellzahl einer möglichst reinen Schwann-Zell-Population für eine autologe Transplantation beim Hund bereitgestellt werden.

In der vorliegenden Studie wurde 26 paraplegischen Hunden mit einem Bandscheibenvorfall in einem thorakolumbalen Rückenmarkssegment im Rahmen einer standardmäßig durchgeführten Hemilaminektomie ein Spinalnervbioptat aus dem betroffenen Rückenmarkssegment entnommen. Es wurden Daten zu Kultivierungsdauer, Reinheitsgrad und absoluter Zellzahl erhobenen und zwischen Hunden mit akutem/subakutem und chronischem Rückenmarktrauma verglichen. Die Expression des p75-Neurotrophinrezeptors (p75NTR) der Schwann-Zellen diente als Marker für die Reinheitsanalyse. Nach Prädegeneration des Spinalnervbioptats, Dissoziation und zweimaliger Aufreinigung der Schwann-Zell-Kultur mittels magnetic activated cell sorting (MACS) konnten innerhalb von 26 ± 4 Tagen 3.75 x 106 Zellen (Median) mit einer Reinheit von 90.2 ± 8.8 % p75NTR+ Zellen generiert werden. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen Hunden mit akutem/subakutem und chronischem Rückenmarktrauma hinsichtlich erzieltem Reinheitsgrad und Kultivierungsdauer zum Zeitpunkt einer möglichen Transplantation detektiert werden. Hunde mit akutem/subakutem Rückenmarktrauma wiesen allerdings zum Zeitpunkt einer möglichen Transplantation eine signifikant höhere Gesamtzellzahl nach zweimaliger Aufreinigung mittels MACS im Vergleich zu Hunden mit chronischem Rückenmarktrauma auf.

Neben der Etablierung des Protokolls zur Isolierung, Aufreinigung und Kultivierung der Schwann-Zellen aus den Spinalnervbioptaten wurde in der vorliegenden Arbeit die Durchflusszytometrie zum Reinheitsnachweis der Schwann-Zellen anhand ihrer p75NTR-Expression evaluiert. Der Vergleich mit Ergebnissen der Immunfluoreszenz bestätigte die Durchflusszytometrie als effektive und verlässliche Methode zur Bestimmung der Reinheit der Schwann-Zell-Population.

Mittels des etablierten Protokolls ist es möglich, eine ausreichend hohe Gesamtzellzahl einer sehr reinen Schwann-Zell-Population aus dem geringen Volumen eines Spinalnervbioptats paraplegischer Hunde für eine autologe Transplantation bereitzustellen. Da die Bioptate über den Zugang der dekompressiven Chirurgie entnommen werden können, ist kein zusätzlicher Zugang für die Bereitstellung des Ausgangsmaterials zur Schwann-Zell-Isolation nötig. Die Gewinnung des Ursprungsmaterials aus einem traumatisierten Rückenmarkssegment hat die Isolierung und Aufreinigung kaniner Schwann-Zellen nicht beeinträchtigt. Die isolierten Schwann-Zellen stehen für neue Therapiestrategien wie die autologe Transplantation in verletztes Rückenmarksgewebe zur Verfügung. Aufgrund der pathogenetischen Gemeinsamkeiten von Rückenmarkstraumen bei Hund und Mensch können Therapiestrategien am Hund zudem eine translationale Bedeutung zugesprochen werden.

abstract (englisch)

Traumatic spinal cord injury (SCI) caused by external or internal trauma is a common disease in dogs and results in neurological deficits of different severity. Patients with paraplegia that lost deep pain perception have a poor prognosis regarding functional recovery. Therefore, innovative therapy options such as cell-based transplantation strategies are currently under investigation and Schwann cells show particularly promising properties for supporting potential regeneration after injury in the nervous system. The aim of the present thesis was to establish a protocol for the isolation, purification, and cultivation of canine Schwann cells from dorsal root spinal nerve biopsies with provision of a sufficient total cell count of highly purified Schwann cells for an autologous transplantation in the dog.

Twenty-six dogs with paraplegia due to intervertebral disc herniation in the thoracolumbar spinal cord segments were enrolled in the study. The dogs underwent standard decompressive hemilaminectomy with biopsy of the dorsal root of the spinal nerve of the affected area of the spinal cord. Culture period, purity, and total cell count of the Schwann cell culture were evaluated and the obtained data compared between dogs with acute/subacute and chronic SCI. The expression of the p75 neurotrophin receptor (p75NTR) by Schwann cells was used as marker for purity assessment. After pre-degeneration, dissociation, and a twofold purification by magnetic activated cell sorting (MACS) of the Schwann cell culture 3.75 x 106 cells (median) with a purity of 90.2 ± 8.8 % p75NTR positive cells could be achieved within a time period of 26 ± 4 days. No significant differences could be detected between dogs with acute/subacute and chronic SCI regarding purity and culture period at the time point of a potential transplantation. However, dogs with acute/subacute SCI showed a significantly higher total cell count at the time point of a potential transplantation after twofold purification by MACS compared to dogs with chronic SCI.

Additionally, flow cytometry was evaluated for the determination of the Schwann cell purity by their expression of p75NTR. The results were confirmed by immunocytochemistry and therefore flow cytometry was proven to be an effective and reliable method to assess the purity of the Schwann cell population.

The established protocol enables the provision of a sufficient total cell count of a highly purified Schwann cell population isolated from a very small volume of tissue, a dorsal root spinal nerve biopsy, of paraplegic dogs. Due to biopsy sampling during standard decompressive surgery no additional surgical intervention has to be performed to obtain nerve tissue for Schwann cell isolation. The altered environment of the traumatized spinal cord area at the spinal nerve biopsy site did not impair the isolation and purification of the Schwann cells. The isolated Schwann cell population is available for new treatment strategies such as the autologous transplantation in the severely traumatized spinal cord. Due to pathogenetical similarities of spinal cord injury between humans and dogs innovative treatment strategies used in the dog could also be of great importance for translation to human medicine.

keywords

Schwann-Zellen, Spinalnerv, Rückenmarkstrauma, Schwann cells, spinal nerve, spinal cord injury

kb

4.426