Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Nancy Stanslowsky

Functional differentiation of midbrain neurons from human cord blood-derived induced pluripotent stem cells for transplantation in a rat model of Parkinson’s disease

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105996

title (ger.)

Funktionelle Differenzierung von Mittelhirn-Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen aus Nabelschnurblut für die Transplantation in ein Rattenmodell der Parkinson’schen Krankheit

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/stanslowskyn_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Morbus Parkinson ist eine neurodegenerative Erkrankung, die sich durch ein fortschreitendes Absterben dopaminerger Neurone in der Substantia nigra pars compacta auszeichnet. Gegenwärtige Behandlungsmethoden erbringen zwar symptomatische Linderung, verlangsamen aber weder den Krankheitsverlauf noch führen sie zu einer Regeneration dopaminerger Zellen. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen), die durch Reprogrammierung aus somatischen Zellen erzeugt werden, bergen großes Potential für Zellersatztherapien, da sie eine unerschöpfliche Quelle zur Herstellung patienten-spezifischer Zellen darstellen und für Forschung und regenerative Medizin standardisiert und optimiert werden können. Die momentan häufigste Zellquelle zur Erzeugung von hiPS-Zellen sind somatische Zellen von Erwachsenen. Ein kritischer Aspekt bezüglich deren potentieller klinischer Nutzung sind Mutationen, die sich im Laufe des Lebens ansammeln und an die iPS-Zellen weitergegeben werden. In dieser Arbeit wurde das dopaminerge Differenzierungspotential von iPS-Zellen, die aus juvenilen, humanen Nabelschnurblut-Endothelzellen hergestellt wurden, in vitro und in vivo untersucht.

Im ersten Teil des Dissertationsprojektes erfolgte der Nachweis einer effizienten in vitro Differenzierung von Nabelschnurblut-iPS-Zellen in funktionelle Neurone einschließlich dopaminerger Zellen durch Inhibierung des bone morphogenetic protein (BMP) und transforming growth factor-β (TGF-β) Signalwegs. Da die Funktionalität in vitro kultivierter Neurone von präklinischer und klinischer Bedeutung ist, charakterisierten wir die Zellen elektrophysiologisch und mittels Kalzium-Imaging. Differenzierte Nabelschnurblut-iPS-Zellen wiesen funktionelle neuronale Eigenschaften einschließlich spannungs- und ligandenabhängiger Ionenströme, Aktionspotentialen und synaptischer Aktivität auf (Stanslowsky et al., 2014).

In der zweiten, im Rahmen der Dissertation durchgeführten Studie wurden Nabelschnurblut-iPS-Zellen, die entsprechend eines auf FGF-2-Signalübertragung (Protokoll I) basierenden, dopaminergen Differenzierungsprotokolls generiert wurden sowie die, durch BMP/TGF-β Inhibierung (Protokoll II) erzeugten Neurone in ein Tiermodel der Parkinson’schen Krankheit transplantiert, um deren Überleben und Integration in vivo zu beurteilen. Verglichen mit Protokoll I brachte die in vitro Reifung die doppelte Anzahl an dopaminergen Neuronen aus Nabelschnurblut-iPS-Zellen hervor, die nach Protokoll II differenziert wurden. Nach striataler Transplantation konnten zwar überlebende Zellen mit beiden Protokollen nachgewiesen werden, allerdings zeigten nur Protokoll II-Transplantate TH+-Zellen mit Neuritenaussprossung und Reinnervation des läsionierten Striatums in der Hälfte der transplantierten Tiere. In Protokoll II-Transplantaten konnte nach 3 Wochen in vivo eine reduzierte Anzahl an undifferenzierten, proliferierenden Zellen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu proliferierten die Zellen in Protokoll I-Transplantaten vermehrt weiter, was zu einem tumorähnlichen Transplantatwachstum in zwei aus vier untersuchten Tieren führte (Effenberg et al., submitted).

abstract (englisch)

Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by the progressive loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta. Present treatment strategies provide symptomatic relief but do not slow the progression of the disease or lead to regeneration of dopaminergic cells. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) reprogrammed from somatic cells hold great promise for replacement therapies, as they represent an unlimited source for the generation of patient-specific cells that can be standardized and optimized for research and regenerative medicine. Currently, cell sources for the generation of hiPSCs are mostly somatic cells obtained from aged individuals. A critical issue concerning their potential clinical use are mutations that accumulate over lifetime and are transfered onto iPSCs. In this thesis we investigated the in vitro and in vivo dopaminergic differentiation capacity of iPSCs generated from human cord blood endothelial cells (hCB) as a juvenile cell source.

In the first study we showed the efficient differentiation of hCBiPSCs into functional neurons including dopaminergic cells in vitro by inhibition of bone morphogenetic protein (BMP) and transforming growth factor-β (TGF-β) signaling. Since the functionality of neuronal cells generated in vitro is of high relevance for preclinical and clinical studies, we characterized the cells electrophysiologically and by calcium imaging. Differentiated hCBiPSCs displayed functional neuronal properties including voltage- and ligand-gated ion currents, action potential firing and synaptic activity (Stanslowsky et al., 2014).

In the second study hCBiPSCs differentiated according to an established dopaminergic differentiation protocol encompassing FGF-2 signaling (protocol I) and neurons generated by BMP/TGF-β inhibition (protocol II) were transplanted in an animal model of PD to investigate their in vivo survival and integration. Compared to protocol I, in vitro maturation yielded the twofold amount of dopaminergic neurons using hCBiPSCs differentiated according to protocol II. After striatal transplantation survival of the grafted hCBiPSC-derived cells from both protocols could be demonstrated, however, only the grafts generated by protocol II revealed several TH+ cells with fiber outgrowth and reinnervation of the lesioned striatum in half of the animals analyzed. Reduced numbers of undifferentiated proliferating cells were observed within protocol II-derived grafts after 3 weeks in vivo. In contrast, proliferation still occurred in protocol I-derived grafts, resulting in tumor-like growth in two out of four animals (Effenberg et al., submitted).

keywords

induzierte pluripotente Stammzellen, dopaminerge Differenzierung, Elektrophysiologie, induced pluripotent stem cells, dopaminergic differentiation, electrophysiology

kb

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