Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Ingo Spitzbarth

Morphologische und Transkriptom-basierte Untersuchungen zur Pathogenese demyelinisierender Erkrankungen des zentralen Nervensystems unter besonderer Berücksichtigung der Rolle axonaler De- und Regeneration bei der demyelinisierenden Staupe-Enzephalitis

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109523

title (engl.)

Morphological and transcriptome-based investigations upon the pathogenesis of demyelinating central nervous system diseases with a special focus upon axonal de- and regeneration in canine distemper demyelinating leukoencephalitis

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/spitzbarthi_ws16.pdf

abstract (deutsch)

Demyelinisierende Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) stellen sowohl in der Human- als auch Veterinärmedizin eine Herausforderung an die Forschung dar, da kurative Therapieansätze weiterhin fehlen. Die Multiple Sklerose (MS) als die häufigste demyelinisierende ZNS-Erkrankung des Menschen zeichnet sich neben einer bisher ungeklärten Ätiologie auch pathologisch-morphologisch durch eine ausgesprochen hohe Variabilität der Läsionen aus. So wurden in der Literatur vier unterscheidbare Subtypen aktiv demyelinisierender Läsionen der MS beschrieben, die möglicherweise auf unterschiedliche Ätiopathogenesen zurückzuführen sind. Die Heterogenität der MS spiegelt sich auch in der Vielzahl von experimentellen Tiermodellen wider, die zur Erforschung der Pathogenese demyelinisierender Erkrankungen verwendet werden. In den letzten Jahrzehnten wurden unabhängig voneinander zahlreiche Studien veröffentlicht, die mittels Microarray-Technik Einblicke in globale Transkriptomveränderungen bei der MS und ihren Tiermodellen lieferten.

Die demyelinisierende Staupe-Enzephalitis des Hundes stellt in diesem Zusammenhang ein Modell dar, das als veterinärmedizinisch relevante Entmarkungserkrankung des ZNS pathologisch-morphologische Parallelen mit der MS aufweist und so eines der wenigen nicht-experimentellen Tiermodelle natürlich auftretender, demyelinisierender Erkrankungen darstellt. Darüber hinaus zeichnet sich die demyelinisierende Staupe-Enzephalitis ähnlich wie die MS durch einen früh einsetzenden Axonschaden aus, der im Sinne eines primären Phänomens möglicherweise als Auslösefaktor für konsekutive Demyelinisierung fungiert.

Die Ziele der vorliegenden Dissertation bestanden darin, (i) mittels einer Re- und Metaanalyse publizierter Microarray-Datensätze Gemeinsamkeiten und Unterschiede in der Transkriptom-basierten Pathogenese der MS sowie ihrer Tiermodelle aufzudecken sowie zu untersuchen, ob sich die Transkriptomdaten der verschiedenen Tiermodelle einem der vier spezifischen Subtypen von MS-Läsionen zuordnen lassen. Ein zweites Ziel der Arbeit bestand darin, (ii) mittels Immunhistologie an Paraffinschnitten des Gehirns von Hunden mit spontaner demyelinisierender Staupe-Enzephalitis und einer Re-analyse ausgewählter Gene aus einem öffentlichen zugänglichen Microarray-Datensatz der demyelinisierenden Staupe-Enzephalitis die temporale Entwicklung axonaler De- und Regeneration sowie das mögliche Auftreten Schwann-Zell-vermittelter Remyelinisierung bei der demyelinisierenden Staupe-Enzephalitis zu charakterisieren.

Im ersten Teil der Studie erfüllten Datensätze von MS (n=3), experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE; n=2), Theiler’scher muriner Enzephalomyelitis (TME; n=1) sowie Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-überexprimierender Mäuse (TNF-transgen [TNFtg]; n=1) die Einschlusskriterien. Mittels Listenvergleich der nach Re-analyse identifizierten, differentiell exprimierten Gene (DEG) fand sich eine Schnittmenge von nur 12 DEG, die von allen Tiermodellen und den MS-Datensätzen differentiell exprimiert wurden. Diese Gene waren funktionell insbesondere Makrophagen-assoziierten Prozessen zuzuordnen. Mittels Gene Set Enrichment Analysis wurden über Immunantwort-assoziierte, funktionelle Begriffe hinaus zuvor nicht antizipierte biologische Prozesse wie die Koagulationskaskade als signifikant überrepräsentiert identifiziert. Die Ursachen der verhältnismäßig geringen Schnittmenge zwischen den Transkriptomdaten der MS und ihren Tiermodellen bleiben spekulativ. Neben der Möglichkeit tatsächlicher pathogenetischer Unterschiede müssen auch technische Ursachen, die auf die untersuchten, aus multiplen Spezies stammenden Datensätze zurückzuführen sind, berücksichtigt werden. Basierend auf den Transkriptomveränderungen waren die Tiermodelle am ehesten dem Subtyp I (TNFtg) sowie dem Subtyp II (EAE, TME) der verschiedenen Läsionstypen der MS zuzuordnen. Diese Beobachtung war überraschend, da basierend auf den in der Literatur beschriebenen, durch Oligodendrozyten-Apoptose dominierten, morphologischen Veränderungen bei TNFtg eine Zuordnung zu Subtyp III oder IV antizipiert wurde. Es könnte somit postuliert werden, dass apoptotische Prozesse bei demyelinisierenden Erkrankungen möglicherweise ein eher post-transkriptionelles Phänomen repräsentieren.

Im zweiten Teil der Studie wurden ein früh einsetzender Axonschaden bei der demyelinisierenden Staupe-Enzephalitis beobachtet, der im Hinblick auf eine immunhistologisch detektierte, alterierte Neurofilament-Phosphorylierung bereits vor Einsetzen der Demyelinisierung beobachtet wurde. Diese Ergebnisse unterstützen die Theorie eines primären axonalen Schadens bei der demyelinisierenden Staupe-Enzephalitis, der möglicherweise als Auslösefaktor für sekundäre Demyelinisierungsprozesse fungiert. Während eine erhöhte axonale Expression nicht-phosphorylierten Neurofilaments eine initiale Veränderung bei der demyelinisierenden Staupe-Enzephalitis darstellte, wurde eine reduzierte axonale Expression von Mikrotubuli-Komponenten sowie axonalen Transport-Motorproteinen in fortgeschrittenen Läsionsstadien beobachtet, sodass die Ergebnisse auf einen Zusammenbruch des axonalen Zytoskeletts und axonaler Transportprozesse bei der demyelinisierenden Staupe-Enzephalitis hindeuten. Die immunhistologischen Daten spiegelten sich auch auf Transkriptomebene wider (Herunterregulation multipler Axon-relevanter Gene). Hinweise auf axonale Regenerationsversuche beschränkten sich auf eine heraufregulierte Expression einiger axonaler Gene in chronischen Läsionen im Vergleich zu subakuten Läsionen (Transkriptomdaten) sowie eine erhöhte Immunoreaktivität von hypoxia-inducible factor (HIF)-1A. Während p75-Neurotrophinrezeptor (NTR)-positive, bipolare Zellen in hoher Anzahl in späten Läsionen beobachtet wurden und somit frühere Beobachtungen bestätigt wurden, beschränkte sich eine manifeste, sich durch Periaxin-Immunoreaktivität auszeichnende Schwann-Zell-Remyelinisierung auf nur zwei Läsionen später Stadien.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit machen zum einen deutlich, dass eine Metaanalyse von Transkriptomdaten einen geeigneten Ansatz darstellt, Einblicke in die heterogene Pathogenese demyelinisierender Erkrankungen zu gewinnen. Zukünftige Studien, die Transkriptomdaten von weiteren Tiermodellen liefern sowie eine höhere Anzahl von Datensätzen der MS selbst wären wünschenswert. Die demyelinisierende Staupe-Enzephalitis stellt als natürlich auftretende Erkrankung des Hundes ein translationales Modell für demyelinisierende Erkrankungen dar, das sich durch einen früh einsetzenden Axonschaden mit konsekutivem Zusammenbruch des axonalen Zytoskeletts und axonaler Transportprozesse auszeichnet. Regenerationsversuche wie auch Remyelinisierung durch Schwann-Zellen stellen bei dieser Erkrankung einen sehr begrenzten Prozess dar, sodass die Identifikation von Faktoren, die diese endogenen, regenerativen Prozesse fördern könnten, einen vielversprechenden Ansatz für zukünftige Untersuchungen darstellt.

abstract (englisch)

Demyelinating diseases of the central nervous system (CNS) still lack curative therapies and thus challenge research in both human and veterinary medicine. Multiple sclerosis (MS) represents the most common demyelinating disease in humans. Its etiology is still not fully elucidated and morphologically there is a high variability of lesions. Based on the literature, four different patterns of active demyelinating MS lesions can be distinguished, which potentially point to different etio-pathogeneses. The heterogeneity of MS is also reflected by the abundance of experimental animal models, which are used to investigate certain aspects of its pathogenesis. During the last decades, multiple independent studies were published, which used microarray technique in order to investigate global transcriptome alterations during demyelinating diseases.

Canine distemper virus (CDV)-induced demyelinating leukoencephalitis (CDV-DL) in dogs represents one non-experimental spontaneously occurring model that shares morphological aspects with MS. During CDV-DL there is, similar to MS, early axonal damage, which might function as a triggering mechanism for subsequent demyelination.

The aims of the present project were (i) a re- and meta-analysis of publically available microarray-datasets in order to get insights into commonalities and differences in the transcriptome-based pathogenesis of MS and its experimental animal models. Moreover, the project aimed to investigate whether transcriptome changes of the different animal models may reflect a specific pattern of MS lesions.

A second aim was to (ii) investigate the temporal development of axonal de- and regeneration in CDV-DL using immunohistochemistry and a re-analysis of publically available microarray data of CDV-DL. In addition, the study aimed to identify possible Schwann cell-mediated remyelination.

In the first part of the project, datasets from MS (n=3), experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE; n=2), Theiler’s murine encephalomyelitis (TME; n=1), and tumor necrosis factor transgenic mice (TNFtg; n=1) fulfilled the inclusion criteria. Using a list comparison of differentially expressed genes (DEGs), only 12 genes were found to be shared between MS and all animal models. These genes were mainly related to macrophage functions. Using Gene Set Enrichmet Analysis, besides immune response related functional terms, also non-anticipated terms such as “coagulation” were significantly enriched. The reasons for the relatively low overlap of the transcriptome data between MS and its animal models remain speculative; however, besides true pathogenetic differences, technical-computational factors, such as the datasets itself and the multitude of investigated species, have to be discussed. Based on transcriptome data the animal models predominantly mirrored pattern I (TNFtg) or pattern II (EAE, TME) of MS lesions. This was a surprising result, as reported morphological changes in TNFtg, which are dominated by oligodendrocyte apoptosis, would suggest this model to mainly mimic pattern III or IV of MS lesions. It could thus be speculated that apoptosis might represent a post-transcriptional process in this model, which is not reflected by the transcriptome data.

In the second part of the project, an early axonal damage was observed during the time course of CDV-DL lesions, which at least with respect to an immunohistochemically detected, altered neurofilament phosphorylation, preceded demyelination. These results underline the theory of primary axonal damage with secondary demyelination in CDV-DL. While increased expression of axonal non-phosphorylated neurofilament represented an initial event in CDV-DL, reduced expression of microtubules and axonal transport motor proteins represented subsequent events, indicating breakdown of the axonal cytoskeleton and transport machinery. The immunohistochemical data were mirrored by transcriptome data in many aspects (down-regulation of axon-relevant genes). Hints for axonal regeneration were restricted to up-regulated expression of few genes in chronic lesions as compared to subacute lesions and up-regulated expression of hypoxia inducible factor (HIF)1A on the protein level. While p75 neurotrophin receptor (NTR)-positive bipolar cells were observed in high numbers in advanced lesions, thus substantiating previous observations, manifest Schwann cell remyelination was restricted to only two advanced lesions, as demonstrated with immunohistochemistry for periaxin.

The results of the present thesis demonstrate that metaanalyses of transcriptome data represent a suitable approach to get insights into the heterogeneous pathogenesis of demyelinating diseases. There is a high demand for future transcriptome studies using other animal models and MS lesions itself. CDV-DL represents a naturally occurring translational animal model for demyelinating diseases, which is characterized by early axonal damage with consecutive breakdown of axonal cytoskeleton and transport processes. Axonal regeneration and remyelination by Schwann cells are limited in CDV-DL. Thus, an identification of possible factors, which could enhance such limited regenerative processes represents a promising target for future studies.

keywords

Demyelinisierung, Microarray, Axonpathologie; demyelination, microarray, axon pathology

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