Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Susanne Spittel

Vergleichende Untersuchungen boviner Milchproben von norddeutschen Milchviehbetrieben mittels bakteriologischer Kultur und kommerzieller real-time Polymerasekettenreaktion

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105987

title (engl.)

Comparative analyses of bovine milk samples from Northern German dairy farms with bacterial culture and commercial real-time polymerase chain reaction assay

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/spittels_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Auf vier Milchviehbetrieben in der Region Osnabrück wurden unter aseptischen Bedingungen 681 Viertelanfangsgemelksproben von 173 hinsichtlich klinischer Mastitis unauffälligen Kühen entnommen. Laut voriger Milchkontrolle wurden Kühe verschiedener Zellgehaltsklassen von unter 100 000 Zellen/ml bis über 1 000 000 Zellen/ml ausgewählt. Nach Aliquotierung wurden die Proben von verschiedenen Laboren mittels bakterieller Kultur und einer kommerziellen real-time PCR (PathoProof™ Mastitis PCR assay, Finnzymes-Thermo Fischer Scientific, Espoo, Finnland) auf das Vorliegen von Mastitiserregern untersucht. Zusätzlich wurde je Kuh eine gepoolte Milchprobe aus allen Eutervierteln mittels PCR untersucht. Darüber hinaus wurde der somatische Zellgehalt mittels Fossomatic™ (Foss, Hillerod, Dänemark) bestimmt.

In der bakteriologischen Untersuchung waren 32,2% (n=219) der Proben positiv, davon zu 94,5% (n=207) mit nur einem nachgewiesenen Erreger, zu 5,0% (n=11) mit zwei und zu 0,5% (n=1) mit drei nachgewiesenen Erregern. Die PCR hingegen wies in 70,6% (n=481) der Proben bakterielle DNS nach. Darunter waren 56,3% (n=271) Einfachnachweise, 34,3% (n=165) Zweifach-, 7,9% (n=38) Dreifach-, 1,0% (n=5) Vierfach- und 0,4% (n=2) Fünffachnachweise von verschiedenen Erregern. Die am häufigsten nachgewiesenen Erreger waren mit beiden Methoden Coryneforme (BU: 18,8%; PCR: 47,7%), KNS (BU: 5,3%; PCR: 34,5%) und S. aureus (BU: 5,0%; PCR: 9,5%). Dann folgte in der PCR T. pyogenes mit 7,2%, welcher in der Bakteriologie erst an sechster Stelle stand (0,3%), danach mit beiden Methoden S. uberis (BU: 1,9%; PCR: 7,0%). Damit ergibt sich eine mit anderen Studien vergleichbare Erregerprävalenz. Das Betalaktamase-Gen wurde bei 37,0% der KNS- und 27,7% der S. aureus-Befunde in der PCR nachgewiesen.

In 60,0% der kulturell negativen Proben konnte die PCR Mastitiserreger nachweisen, deren Zusammensetzung etwa den Gesamtprävalenzen mittels PCR entsprach. Es gab 15 PCR negative, kulturell positive Proben, in denen u.a. Hefen nachgewiesen wurden. Für S. aureus, S. uberis, KNS und Coryneforme waren die ct-Werte in den übereinstimmend positiven Befunden signifikant niedriger (mehr DNS vorhanden) als in den ausschließlich mit PCR positiven (BU negativen) Proben (P<0,0001). Dies lässt auf eine höhere Nachweisgrenze der Kultur, auf eine überstandene Infektion mit nicht (mehr) lebensfähigen Erregern, aber auch auf mögliche Kontamination schließen.

Unter Annahme des Goldstandards Bakteriologie wurde eine niedrige Sensitivität von 9,1% für Enterococcus spp. berechnet. Für S. uberis, KNS, S. aureus waren die Sensitivitäten moderat (76,9% bis 79,4%), für Coryneforme, T. pyogenes und S. dysgalactiae waren sie hoch (95,3% bis 100%). Die Spezifitäten waren moderat für Coryneforme und KNS (63,3% bzw. 67,9%) und hoch für T. pyogenes, S. aureus, S. uberis, S. dysgalactiae und Enterococcus spp. (93,1% bis 99,6%). Die positiven prädiktiven Werte der PCR reichten von 4,1% für T. pyogenes bis 41,5% für S. aureus. Die negativen prädiktiven Werte hingegen waren für alle Erreger höher als 98%. Die Testgenauigkeit lag bei knapp 70% für KNS und Coryneforme, bei über 93% für die übrigen Erreger.

Die PCR-Poolproben der einzelnen Kühe wurden mit den zugehörigen Viertelgemelksproben hinsichtlich des Vorliegens von hauptsächlichen Mastitiserregern (d.h. alle außer KNS und C. bovis) verglichen: 72,3% stimmten überein, bei 22,0% fehlten Erreger aus den Vierteln in der Poolprobe, 1,7% der Poolproben waren falsch positiv, die restlichen stimmten nicht oder nur teilweise überein. Der Informationsverlust bei einem Fünftel der Proben schränkte die Aussagekraft von Poolproben deutlich ein.

Nachweise mehrerer Mastitiserreger in einer Probe sind bei der Interpretation von bakteriologischen Befunden problematisch. Laut Diagnostikstandards sind Proben ab drei verschiedenen Kolonietypen als kontaminiert einzustufen, sodass eine Nachbeprobung empfohlen wird. Für die neuartige Mastitis-PCR-Diagnostik gibt es derzeit keine entsprechenden Standards. Daher wurden in dieser Studie die PCR-Befunde für die am häufigsten nachgewiesenen Erreger, C. bovis, KNS, S. uberis, S. aureus und T. pyogenes, gruppiert hinsichtlich der Anzahl weiterer in derselben Probe enthaltener Erreger. Für die Gruppen Einzelnachweis (kein weiterer Erreger), Doppelnachweis (ein weiterer Erreger) und Mischnachweis (zwei und mehr weitere Erreger) wurde die Anzahl von Proben über 100 000 Zellen/ml (Schwellenwert für entzündliche Reaktion des Euters), der Mittelwert des natürlichen Logarithmus des somatischen Zellgehaltes (lnSCC) und der Mittelwert des ct-Wertes (DNS-Quantität) errechnet und verglichen. Im Falle von echten Infektionen wurden viele Proben über 100 000 Zellen/ml, hohe somatische Zellgehalte und viel Erreger-DNS (niedrige ct-Werte) erwartet; für Kontaminationen das Gegenteil. Alle drei untersuchten Parameter unterschieden sich signifikant zwischen den S.-uberis–Gruppen (P<0,05). Der lnSCC war in den Einzel- und Doppelnachweisen signifikant höher als in den Mischnachweisen (P<0,05), welches die letztgenannten als wahrscheinlich kontaminiert einstuft. Für S. aureus stieg der lnSCC tendenziell mit der Anzahl weiterer Erreger. Innerhalb der KNS-Gruppen schwankte der Anteil an Proben über 100 000 Zellen/ml und der lnSCC. Hingegen konnten keine signifikanten Unterschiede für T. pyogenes und C. bovis ermittelt werden. Bezüglich der Gesamtnachweise der einzelnen Erreger kamen S. uberis und T. pyogenes eher in Doppel- und Mischnachweisen vor, wohingegen S. aureus, KNS und C. bovis eher in Einzel- oder Doppelnachweisen auftraten. An der Zusammensetzung der Doppel- und Mischnachweise waren vor allem C. bovis und KNS beteiligt, danach folgten T. pyogenes und S. uberis.

Die PCR war mit ihrer hohen Sensitivität in der Lage, mehr Mastitiserreger zu finden als die bakterielle Kultur. Für S.-uberis-Befunde in Einzel- und Doppelnachweisen konnte eine entzündliche Reaktion nachgewiesen werden, sodass eine Abgrenzung zur Kontamination auch mittels PCR möglich war. Dreizehn kulturellen S.-uberis-Nachweisen standen in dieser Studie 48 PCR-Nachweise gegenüber, von denen 28 als ätiologisch bedeutsam eingeordnet werden konnten (hoher SCC). Für die Diagnose von Mastitiden, hervorgerufen durch diesen Umwelterreger, scheint daher die PCR in Verbindung mit Zellgehaltsmessung die geeignetere Methode zu sein als PCR allein.

abstract (englisch)

On four dairy farms in the region of Osnabrück, Germany, 681 quarter milk samples from 173 clinically mastitis free cows were collected under aseptic conditions. According to the last dairy herd improvement sampling, cows were selected representing different somatic cell count classes from below 100 000 cells/ml to more than 1 000 000 cells/ml. Subsequent to aliquotation, samples were analysed in different laboratories for mastitis pathogens by means of bacterial culture and commercial real-time PCR (PathoProof™ Mastitis PCR assay, Finnzymes-Thermo Fischer Scientific, Espoo, Finland). Additionally, for each cow a pooled sample from the quarters was analyzed by PCR. Furthermore, somatic cell counting was performed (Fossomatic™, Foss, Hillerod, Denmark).

In bacterial culture, 32.2% (n=219) of the samples were positive: 94.5% (n=207) of them were positive for only one pathogen, 5.0% (n=11) for two and 0.5% (n=1) for three species. On the other hand, PCR detected bacterial DNA in 70.6% (n=481) of the samples. Among them were 56.3% (n=271) single detections, 34.3% (n=165) double detections, 7.9% (n=38) triple detections, 1.0% (n=5) detections with four and 0.4% (n=2) detections with five different bacterial species. With both methods, the most frequently identified bacteria were coryneforms (culture: 18.8%; PCR: 47.7%), CNS (culture: 5.3%; PCR: 34.5%) and S. aureus (culture: 5.0%; PCR: 9.5%), followed by T. pyogenes with PCR (7.2%; rank six in culture with 0.3%) and then, again with both methods, S. uberis (culture: 1.9%, PCR: 7.0%). Thereby, prevalence was comparable to other studies. The beta-lactamase gene was found in 37.0% of the CNS- and in 27.7% of the S. aureus detections.

In 60.0% of the bacteriologically negative samples, PCR was able to find bacterial DNA approximately representing the overall prevalences with PCR. There were 15 PCR negative, but culture positive samples, where amongst others yeasts were isolated. For S. aureus, S. uberis, CNS and coryneforms ct values were significantly lower (more DNA was present) in the congruently positive samples than in the solely PCR positive (culture negative) samples (P<0.0001). This could suggest a higher detection threshold with culture, non-viable bacteria from a previous infection, but also contamination.

Using bacterial culture as gold standard, a low sensitivity was calculated for Enterococcus spp. (9.1%). Sensitivities were moderate (76.9% 79.4%) for S. uberis, CNS, S. aureus and high (95.3% 100%) for coryneforms, T. pyogenes and S. dysgalactiae. Specificities were moderate for coryneforms and CNS (63.3% and 67.9%, respectively) and high for T. pyogenes, S. aureus, S. uberis, S. dysgalactiae and Enterococcus spp. (93.1% 99.6%). The positive predictive values ranged from 4.1% for T. pyogenes to 41.5% for S. aureus. Negative predictive values exceeded 98% for all bacteria. Accuracy was just under 70% for CNS and coryneforms and higher than 93% for the other species.

The pooled PCR samples of the individual cows were compared with the respective udder quarter results with regard to the presence of major mastitis pathogens (i.e. others than CNS and C. bovis): 72.3% completely matched, in 22.0% bacteria from the quarters were not detected in the pooled sample, 1.7% of the pooled samples were false positive and the rest showed none or only partial congruence. The loss of information in one-fifth of the samples limited the value of the pooled samples.

Growth of multiple mastitis pathogens from one sample is critical in bacterial culture. According to diagnostic standards, samples with three or more colony types are considered contaminated and should be resampled. For the novel mastitis PCR such standards do not yet exist. Therefore, in this study, PCR detections of the most frequent bacteria, C. bovis, CNS, S. uberis, S. aureus and T. pyogenes, were grouped according to the number of additionally detected pathogens. For the groups single detection (no further species), double detection (one further species) and mixed detection (two or more further species) the number of samples above 100 000 cells/ml (threshold value for an inflammatory reaction), the mean of the natural logarithm of the somatic cell count (lnSCC) and the mean of the ct value (DNA quantity) were calculated and compared. In the case of true infections, many samples above 100 000 cells/ml, high somatic cell counts and a high quantity of bacterial DNA (low ct values) were expected; the opposite was expected for contamination. All the three parameters differed significantly between the S. uberis groups (P<0.05). In single and double detections, the lnSCC was significantly higher than in mixed detections (P<0.05), rating the latter as probably contaminated. For S. aureus, lnSCC tended to rise with the number of further species. Within the CNS groups, the percentage of samples above 100 000 cells/ml and the lnSCC fluctuated. In contrast, no differences were observed for T. pyogenes and C. bovis. With respect to all detections, the pathogens S. uberis and T. pyogenes were more often found in double and multiple detections, whereas S. aureus, CNS and C. bovis were more frequent in single and double detections. C. bovis and CNS were mainly involved in the composition of double and mixed identifications, followed by T. pyogenes and S. uberis.

Due to its high sensitivity, PCR was able to detect more mastitis pathogens than bacterial culture. For S. uberis identifications in single and double detections, an inflammatory reaction could be proven enabling a distinction between infection and contamination. In this study, as opposed to 13 S. uberis findings with culture, there were 48 identifications with PCR of which 28 were considered as etiologically significant (high SCC). Therefore, PCR in connection with somatic cell counting seemed to be the more suitable method for diagnosing mastitis due to this environmental pathogen than PCR alone.

keywords

Mastitis, Milchkuh, Polymerasekettenreaktion; mastitis, dairy cow, polymerase chain reaction

kb

116