Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Anne Christiane Spannbrucker

Einfluss von Follikelgröße und Medienzusatz auf die In-vitro-Maturation porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105263

title (engl.)

Effect of follicle size and medium supplement on the in vitro maturation of porcine cumulus oocyte complexes

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/spannbruckera_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Kleine Follikel sind auf der Oberfläche der Ovarien von nicht zyklischen Tieren deutlich überrepräsentiert und die aus ihnen gewonnen Oozyten weisen häufig eine reduzierte Entwicklungskompetenz auf. Ein Untersuchungsschwerpunkt dieser In-vitro-Studie war es, diese verminderte Entwicklungsfähigkeit im Vergleich mit Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOKs) aus großen Follikeln nachzuweisen und näher zu charakterisieren. In der vorliegenden Arbeit wurde außerdem untersucht, welchen Einfluss ein definiertes Maturationsmedium auf die In-vitro-Maturation (IVM) von KOKs aus unterschiedlich großen Follikeln hat und ob eine reduzierte Reifungsfähigkeit von Eizellen aus kleinen Follikeln ausgeglichen werden kann.

Dafür wurden Follikel der Ovarien präpubertärer Schlachtschweine aufgrund ihres Durchmessers in die Kategorie „kleine Follikel“ (KF, 2,5–4,0 mm) oder die Kategorie „große Follikel“ (GF, 4,5–6,0 mm) eingeordnet. Die Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) wurden aus diesen Follikeln isoliert und über unterschiedliche Zeiträume in Medium, das entweder mit fetalem Kälberserum (FKS) oder Polyvinylalkohol (PVA) und epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) supplementiert wurde, kultiviert. Um mögliche Unterschiede zu charakterisieren, wurde der Kernreifungsstatus, die parthenogenetische Aktivierbarkeit und der cAMP-Gehalt der Oozyten, die Steroidhormonsekretion der Kumuluszellen während der IVM sowie die mRNA-Expression des Enzyms 3β-Hydroxysteroiddehydrogenase (3β-HSD) und der LH- Rezeptoren in den Kumuluszellen analysiert.

In Übereinstimmung mit den Ergebnissen anderer Forschungsgruppen konnten weder zwischen den gewählten Follikelgruppen noch zwischen den Medienzusätzen Unterschiede bezüglich der Kernreifung festgestellt werden. Der Einfluss der Follikelgröße zeigte sich jedoch nach parthenogenetischer Aktivierung der Eizellen darin, dass sich die Oozyten aus GF vermehrt bis zum Vierzellstadium entwickelten, wobei Oozyten aus KF häufiger Zweizellstadien aufwiesen. Der Medienzusatz erwies sich ebenfalls als Einflussfaktor, da sich, unabhängig von der Follikelgröße, mehr Oozyten nach IVM im FKS-supplementiertem Medium bis zum Vierzellstadium entwickelten, als diejenigen, die zuvor in PVA-Medium kultiviert wurden.

Mit den Ergebnissen der Steroidhormonsynthese wurde ebenfalls ein Einfluss der Follikelgröße deutlich. Die 17ß-Estradiol (E2)-Synthese in den ersten 28 h der IVM von KOKs aus KF war im Vergleich zu KOKs aus GF signifikant geringer. Im Gegensatz dazu sezernierten die KOKs aus KF mehr Progesteron (P4), als KOKs aus GF, allerdings nur, wenn FKS als Medienzusatz verwendet wurde.

Die mRNA-Expression des LH-Rezeptors in den Kumuluszellen zeigte in beiden Medienzusätzen auffällige unterschiedliche Verlaufsmuster, jedoch ohne statistische Relevanz. Die mRNA-Analyse der Expression von 3ß-HSD ergab innerhalb der verschiedenen Gruppen ähnliche Ergebnisse. Für beide Enzyme wurde eine reduzierte mRNA-Expression nach 28 h in Kumuluszellen aus GF deutlich, jedoch nur nach Kultivierung im PVA-Medium.

Die Ergebnisse der cAMP-Messungen in den Eizellen zeigten weder eine Beeinflussung durch die gewählten Medienzusätze noch durch die Follikelklassen.

Die vorliegende Arbeit gibt Hinweise darauf, dass Oozyten aus kleineren Follikeln mit meiotischer Kompetenz Defizite bezüglich ihrer zytoplasmatischen Reife aufweisen, die durch den Einsatz eines definierten Mediums verstärkt werden. Die Hormonanalysen zeigten, dass KOKs aus KF unter FKS-Einfluss eine stärkere Luteinisierung aufwiesen, als KOKs aus GF, was jedoch durch die Verwendung eines serumfreien Maturationsmediums kompensiert werden kann. Außerdem wurde anhand der Ergebnisse beider Follikelklassen deutlich, dass gegen Ende der IVM in FKS-Medium kein erkennbarer Wechsel von der Estradiol- zur Progesterondominanz stattfindet. Die Signalvermittlung über cAMP konnte als Ursache für eine verminderte Reifungskompetenz von Oozyten ausgeschlossen werden.

abstract (englisch)

Small follicles are over-represented on the surface of ovaries of non-cycling pigs and the oocytes collected from these follicles commonly show a reduced developmental competence. One focus of this in vitro study was to confirm and to distinguish this lower developmental competence compared to cumulus oocyte complexes from large follicles. The present study analysed the influence of a defined maturation medium on the in vitro maturation (IVM) of cumulus oocyte complexes in different follicle sizes and it was also investigated if the reduced developmental competence can be compensated.

Therefore, based on their diameter, follicles on ovaries of prepubertal pigs were classified in the following categories: “small follicles” (2,5–4,0 mm) or “large follicles” (4,5–6,0 mm). The cumulus oocyte complexes were isolated from these follicles and cultivated for different periods in a medium, supplemented either with fetal calf serum or with polyvinyl alcohol and epidermal growth factor (EGF). To detect potential differences the nuclear maturation, the parthenogenetic activation, the cyclic AMP content of the oocytes, the steroid hormone secretion in the cumulus cells during IVM and the mRNA expression of the enzyme 3β-Hydroxysteroiddehydrogenase (3β-HSD) and the luteinizing hormone receptor (LH receptor) in the cumulus cells were analysed.

In agreement with the results of other research groups, no differences were detected concerning the nuclear maturation, neither in the different follicle size groups, nor in the medium supplements. The influence of the follicle size became obvious after parthenogenetic activation when oocytes from large follicles had mainly developed to the 4-cell stage, whereas oocytes from small follicles increasingly displayed parts of the 2-cell stage. The medium supplement also turned out to be a factor, because independently from the size of the follicle, more oocytes cultured in a medium with fetal calf serum developed to the 4-cell stage than oocytes cultured in PVA-supplemented medium.

The results from the steroid hormone synthesis also indicated the effect of the follicle size. The 17β-estradiol synthesis during the first 28 h of the IVM of cumulus oocyte complexes from small follicles was significantly lower than in cumulus oocyte complexes from large follicles. In contrast, cumulus oocyte complexes from small follicles secreted significantly higher amounts of progesterone than cumulus oocyte complexes from large follicles. This however was only the case when fetal calf serum was added to the medium.

The mRNA expression of LH receptors in the cumulus cells indicated a different progression for the medium supplements, but without statistical relevance. The mRNA analysis of the 3β-HSD expression resulted in similar findings for the different groups.

The results from the cAMP-determination in the oocytes showed no influence of the medium supplement or of the follicle size.

The present study indicates that oocytes from small follicles with meiotic competence display deficiencies concerning the cytoplasmic competence, which are increased when matured in a defined medium. The hormone analysis showed that cumulus oocyte complexes from small follicles more intensely luteinized under the influence of fetal calf serum than cumulus oocyte complexes from large follicles. This effect was compensated with the use of a serum free medium. Furthermore regarding the results from both follicle classes, it became clear that at the end of the IVM in fetal calf serum supplemented medium, there was no switch from estradiol to progesterone predominance. The cAMP signal transduction could be eliminated as a cause for the lower developmental competence of oocytes.

keywords

Eizelle, Maturation, Follikelgröße. Oocyte, maturation, follicle size

kb

2.275