Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 Dai-Lun Shin

 Studies on the Host Genetic Resistance and Susceptibility to Influenza A Virus

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106930

title (ger.)

Untersuchungen zur genetischen Wirtsresistenz und der Empfänglichkeit für Influenza A Viren

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/shind_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Infektionen durch Influenzaviren stellen eine ernste Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar und verursachen respiratorische Erkrankungen bei Mensch und Tier. Viele biologische Mechanismen der Wirt-Pathogen-Interaktionen nach einer Influenza A-Virus (IAV)-Infektion sind immer noch unklar. Sowohl intrinsische als auch extrinsische Faktoren bestimmen den Schweregrad der Influenza-Erkrankung.

Um Virulenzfaktoren auf der Virus- und Wirtsseite zu untersuchen, analysierte ich in meiner These, wie unterschiedliche genetische Hintergründe des Wirtes die Funktion des Orthomyxoviridae-Resistenzgens 1 (Mx1) beeinflussen. Es ist früher gezeigt worden, dass kongene Mäuse, B6.A2G-Mx1r/r (B6-Mx1r/r), die ein funktionelles Mx1-Allel tragen, höchst resistent sind gegenüber IAV. Insbesondere für das vom Typ I Interferon induzierte Protein Mx1 ist gezeigt worden, dass es einen starken Effektor der angeborenen Immunantwort darstellt und dass es den Kerntransport der Virus-RNA blockiert und die virale Replikation hemmt. Um den Einfluss des genetischen Hintergrundes auf die Mx1-Funktion zu bestimmen, verglich ich die Wirtsantwort auf eine IAV-Infektion in kongenen B6-Mx1r/r-Mäusen mit der in kongenen D2(B6).A2G-Mx1r/r (D2-Mx1r/r)-Mäusen. Äußerst überraschend waren kongene D2-Mx1r/r-Mäuse, die ein funktionelles Mx1-Wildtyp-Allel exprimierten, äußerst empfänglich für eine H1N1-Virusinfektion. Ich beobachtete, dass die Zahl der überlebenden Tiere sowohl vom genetischen Hintergrund als auch von der Kopienzahl funktioneller Mx1-Allele abhing. Außerdem beeinflusste der genetische Hintergrund die antivirale Aktivität von Mx1, indem es nach einer Infektion den Virustiter in der Lunge regulierte. Die Infektion von D2-Mx1-Mäusen führte zu einer 100-fach höheren Viruslast in den Lungen im Vergleich zur Infektion von B6-Mx1r/r. Im Gegensatz dazu reduzierten die kongenen B6-Mx1r/r-Mäuse das Virus früher und entwickelten keine schwere Krankheit. Weiterhin waren D2-Mx1r/r-Mäuse, die mit Interferon a vorbehandelt wurden, vollkommen geschützt vor tödlichen Infektionen. Diese Beobachtungen legen nahe, dass B6-Mäuse genetische Faktoren tragen, die die Mx1-Funktion initiieren und die bei D2-Mäusen fehlen. Weiterhin repliziert das Virus bei einem D2-Hintergrund sehr schnell zu frühen Zeitpunkten und protektive Mx1-Funktionen werden zu spät aktiviert, um einen schweren Infektionsverlauf zu verhindern.

Im zweiten Teil meiner Dissertation habe ich die Bedeutung der Fibrinolyse und der vaskulären Permeabilität im Kontext einer IAV Infektion untersucht. Aktuelle Studien haben gezeigt dass eine IAV Infektion zu einer Veränderung des Plasminogenkonversion und -homöostase führt. Während dieser Arbeit habe ich die Infektion durch zwei IAV Stämme, PR8 und WSN, untersucht. Der WSN Stamm besitzt eine einzigartige Neuraminidase, welche dazu fähig ist Plasminogen in Plasmin umzuwandeln und so die Spaltung des Hämagglutinins durch aktiviertes Plasmin in der Abwesenheit von anderen Serinproteasen des Wirtes ermöglicht. In Mäusen kann sich der WSN Stamm in extra-pulmonale Organe ausbreiten, während der PR8 Stamm auf den Respirationstrakt beschränkt bleibt. Während meiner Arbeit habe ich untersucht ob die Ausbreitung des WSN Stammes mit der Hyperfibrinolyse durch Plasminogenkonversion in Verbindung steht. Dazu habe ich die Antwort des Wirtes und die Virusreplikation in Mäusen untersucht, welche einen Gen-Knockout für das Serpine1 Gen besaßen. Ich konnte zeigen, dass Serpine1 Knockout Mäuse im Vergleich zu wildtyp Mäusen eine höhere Empfänglichkeit für die Infektion durch IAV vom Subtyp H1N1 aufwiesen. Die erhöhte Empfänglichkeit wurde durch eine verstärkte Fibrinolyse bedingt und führte zu einer Freisetzung von roten Blutzellen in den alveolaren Raum sowie zu einer Virusausbreitung in die Nieren. Zusätzlich zeigten WSN-infizierte wildtyp Mäuse höhere Proteindurchlässigkeit in die Flüssigkeit des bronchoalveolären Raumes als PR8-infizierte Mäuse. Zusammenfassend weisen meine Daten darauf hin, dass eine Fehlregulation der Plasminogenkonversion zu einem schweren Krankheitsverlauf in IAV infizierte Mäuse beiträgt. Hyperfibrinolyse verstärkt Blutungen in der Lunge und erhöht die vaskuläre Permeabilität was möglicherweise zur Virusausbreitung führt.

Weiterhin habe ich die Kinetik der zellulären Veränderungen im peripheren Blut nach einer IAV-Infektion von B6- und D2-Mäusen untersucht. Wir fanden, dass das Verhältnis von Granulozyten zu Lymphozyten im periphären Blut und in der Lunge gut mit dem Schweregrad der Krankheit korrelierte. Durch fluorometrische Analyse fanden wir, dass eine massive Infiltration von Ly6G+CD11b+-Zellen in die Lunge stark assoziiert war mit letalen Infektionen in B6-Mäusen, während D2-Mäuse einen Anstieg der proinflammatorischen Zellen in den Lungen nach IAV-Infektionen zeigten. Die infiltrierten Immunzellen in der Lunge widerspiegelten die quantitativen und qualitativen Unterschiede in der Peripherie.

Außerdem untersuchte ich genetische Varianten des Klrd1-Gens von NK-Zellen. Es wurde berichtet, dass Klrd1 in DBA/2J-Mäusen deletiert ist. Nach der fluorometrischen Analyse von NK-Zellen von D2-Mäusen fanden wir, dass der Unterstamm DBA/2Rj vom Janvier Breeding Centre in Frankreich CD94-Protein exprimiert. Andererseits identifizierten wir durch „High throughput“-Sequenzierung in DBA/2J-Mäusen vom Jackson-Laboratorium eine spontane Deletion, die das letzte kodierende Exon des Klrd1-Gens umfasste. In beiden D2-Unterstämmen wurde auch eine zusätzliche Deletion in der Intron-Gegend zwischen den Exons 2 und 3 identifiziert. Diese Ergebnisse zeigten das Vorhandensein unterschiedlicher Klrd1-Allele in den beiden D2-Unterstämmen.

abstract (englisch)

Influenza infections represent a serious threat to human health and are causing respiratory disease in human and animals. Many of the biological mechanisms of the host-pathogen interactions after influenza A virus (IAV) infection are still unclear. Both intrinsic and extrinsic factors determine the severity of influenza disease.

To study the importance of host and virus virulence factors, I investigated in my thesis how different genetic backgrounds of the host influenced the function of orthomyxoviridae resistance gene 1 (Mx1). It was shown previously that congenic B6.A2G-Mx1r/r (B6-Mx1r/r) mice carrying a functional Mx1 allele are highly resistant against IAV. In particular, the type I interferon induced protein MX1 has been shown to represent a strong effector of innate immunity and to act by blocking nuclear import of viral RNA and inhibits viral replication. To assess the influence of genetic background on Mx1 function, I compared the host response to IAV infection in congenic mice B6-Mx1r/r to congenic D2(B6).A2G-Mx1r/r (D2-Mx1r/r) mice. Most surprisingly, congenic D2-Mx1r/r mice harboring a functional Mx1 wild type allele were highly susceptible to H1N1 virus infection. I observed that the survival proportion was related to both the genetic background and the copy numbers of functional Mx1 alleles. Furthermore, the genetic background influenced Mx1 antiviral activity by regulating virus titer in the lungs after infection. Infection of D2-Mx1r/r mice led to a 100-fold higher viral load lungs compared to infection of B6-Mx1r/r. In contrast, congenic B6-Mx1r/r mice started to reduce virus earlier and did not develop severe disease. Additionally, D2-Mx1r/r mice which were pretreated with interferon α were fully protected from lethal infections. These observations suggest that B6 mice carry genetic factors which initiate Mx1 function and which are absent in D2 mice. Furthermore, in a D2 background, IAV replicates very rapidly at early time points and Mx1 protective functions are activated too late to prevent the severe outcomes.

In the second part of my thesis I investigated in the importance of fibrinolysis and the influence of vascular permeability in the context of IAV infection. Recent studies have shown that IAV alters the plasminogen conversion pathway and hemostasis after infection. Here, I studied infections with two IAV strains, PR8 and WSN. The WSN strain has a unique neuraminidase which can convert plasminogen into plasmin and allows cleavage of the hemagglutinin via activated plasmin in the absence of other host serine proteases. In mice, WSN can disseminate to extra-pulmonary organs while PR8 is restricted to the respiratory tract. In my studies, I investigated if dissemination of WSN was related to hyperfibrionlysis from plasminogen conversion. For this, I studied the host response and virus replication in a mouse knockout mutant of the Serpine1 gene. I showed that Serpine1 mutants were more susceptible to H1N1 infections compared to wild type mice. The increase in susceptibility was caused by an enhancement of fibrinolysis, resulting in leaking of red blood cells into the alveolar space and dissemination of virus into the kidneys. Also, WSN-infected wild type mice showed higher levels of protein leakage into the bronchoalveolar space fluid compared to PR8-infected mice. In conclusion, my results strongly suggest that dysregulation of the plasminogen activation pathway contributes to the enhanced severity in IAV-infected mouse lungs. Hyperfibrinolysis increases lung hemorrhage and enhances vascular permeability which may lead to virus dissemination.

Furthermore, I investigated the kinetics of cellular changes in the peripheral blood after IAV infection of B6 and D2 mice. We observed that the ratio of granulocytes to lymphocytes in the peripheral blood and lung correlated well with disease severity. By fluorometric analysis, a massive infiltration of Ly6G+CD11b+ cells in the lung was detected which was strongly associated with the lethal infection in B6 mice, whereas D2 mice showed an increase in proinflammatory cells in the lungs after IAV infections. These immune cell infiltrates of the lung reflected quantitative and qualitative differences in the periphery.

In addition, I investigated genetic variants of the NK cell gene Klrd1. It was reported that Klrd1 is deleted in DBA/2J mice. After performing fluorometric analyses of NK cell from D2 mice, I could further show that the sub-strain DBA/2Rj stock from the Janvier Breeding Centre in France expresses the CD94 protein. On the other hand, I identified a spontaneous deletion spanning the last coding exon of the Klrd1 gene in DBA/2J mice from the Jackson laboratory by high throughput sequencing. An additional deletion in the intronic region between exons 2 and 3 was also identified in both D2 sub-strains. These results revealed the presence of different Klrd1 alleles in these two D2 sub-strains.

keywords

Influenza A virus, Mx1, Mouse genetic, Influenza-A-Viren, Mx1, Infektionsgenetik

kb

2.133