Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Omar Hashim Sheet

 

 Identification and characterization of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis milk in Northern Germany

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109493

title (ger.)

Identifizierung und Charakterisierung von Staphylococcus aureus Isolaten aus boviner Mastitismilch aus Norddeutschland

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/sheeto_ws16.pdf

abstract (deutsch)

Der LAMP-Assay (Loop-Mediated Isothermal Amplification) wird al seine der effizientesten Methoden erachtet, tierische und humane, pathogene Keime zu detektieren, da damit unter isothermalen Bedingungen DNS schnell und mit hoher Effizienz und Spezifität amplifiziert werden kann. S. aureus ist einer der wichtigsten Krankheitserreger, der Mensch und Tier gleichermaßen betreffen kann. Bei Milchrindern stellt die Mastitis durch S. aureus einen wichtigen wirtschaftlichen Faktor dar, und die Herdenbetreuung hinsichtlich der Eutergesundheit hängt von einer schnellen und korrekten Erregerabklärung ab. Die vorliegende Studie bestand aus zwei Teilen: Erstens die Entwicklung und Validierung eines neuen LAMP assay für den Nachweis von S. aureus und zweitens die phänotypische und genotypische Charakterisierung von S. aureus aus Mastitismilch.

Das „Loop-Mediated Isothermal Amplification assay“ ist eine breitanzuwendende und innovative Methode für die Gen-Amplifikation. Sie wird als leicht durchzuführende und schnelle diagnostische Methode betrachtet, welches eine hohe Spezifität und Sensitivität für die Erkennung und Identifizierung von Pathogenen aufweist. In dieser Studie wurde auf der Basis des nuc-Gens ein LAMP-Assay für die Identifizierung von S. aureus entwickelt und validiert. Die Spezifität des LAMP-Assays wurde anhand von 70 S. aureus-Isolaten bestätigt. Die Proben bestanden aus bovinen Mastitis-Milchproben, die in der Zeit von August 2001 bis März 2014 aus verschiedenen Regionen in Norddeutschland gesammelt wurden. Des Weiteren wurden 21 Bakterienstämme gesammelt, die nicht von S. aureus stammen. Die Ergebnisse des LAMP-Assays ermöglichten einen Nachweis des nuc-Gens in allen untersuchten S. aureus-Isolaten (100%), während es kein Signal bei einem der getesteten Nicht-S. aureus-Stämme gab. Die analytische Sensitivität des entwickelten LAMP-Assays betrug 0,25 pg von der S. aureus-DNA pro Reaktion. Die Nachweisgrenze betrug 9×102 CFU mL-1. Um die Nachweisgrenze zu bestimmen, wurde herkömmliche Milch mit S. aureus künstlich kontaminiert. Das entwickelte LAMP-Assay ist eine schnelle Nachweismethode für die Identifizierung von S. aureus, welcher eine hohe Speziftät und Sensitivität aufweist. Das Real-Time-Fluorometer ermöglicht eine Identifizierung von S. aureus in weniger als zwei Stunden (einschließlich der DNA-Extraktion). Deshalb ist diese Methode eine schnelle, flexible und einfache Methode, um S. aureus nachzuweisen.

Um die molekulare Ökologie von S. aureus zu verstehen, wurden in dieser Studie die phänotypischen und genotypischen Merkmale von 70 S. aureus-Isolaten verglichen. Alle S. aureus-Isolate wurden phänotypisiert. Außerdem wurde ihre genetische Vielfalt anhand der „multilocus sequence typing“-Methode (MLST) und der „Staphylokokken Protein (spa) typing“-Methode charakterisiert. Für die Anwesenheit von virulententen Genen wurden 16 Staphylokokken-Enterotoxine (sea-selu), das „Toxic-Shock-Syndrom-Toxin“ (tst), die Thermonuklease (nuc), der Clumping-Faktor (clfA und clfB), die Koagulase und das Methicillin-resistente-Gen mecA kodiert. Außerdem wurde die vorliegende Studie durchgeführt, um die Beziehungs zwischen S. aureus-Isolaten mit dem Profil von 118 menschlichen S. aureus Stämmen in Deutschland und dem Profil von 33 S. aureus-Stämmen von boviner Mastitis aus verschiedenen europäischen Länden festzustellen.

Der „Staphaurex-Test“ (Clumping Faktor und Protein A) zeigte, dass 75,7% der Isolate positiv waren. Weiterhin reagierten alle untersuchten Isolate im Katalase-Test positiv. Das „API 32 Staph identifikation system“ bestätigte, dass alle Isolate auch S. aureus waren. Gemäß dem „antimicrobial susceptibility–Test“ waren alle untersuchten S. aureus-Isolate sensitiv gegenüber Methicillin, wohingegen die Isolate eine hohe Resistenz gegenüber Penicillin und Ampicillin zeigten.

Durch die MLST-Analyse konnten 16 verschiedene Sequenz-Typen (ST) ermittelt werden. Sechs von diesen waren neue STs, welche als ST2821, ST2823, ST2824, ST2825, ST2826 und ST2827 bezeichnet wurden. Insgesamt wurden 16 Sequenz-Typen in acht „clonal complex“ (CCs) unterteilt. Weiterhin wurden siebzehn verschiedene spa-Typen identifiziert und ein neuer spa-Typ (t13769) gefunden. Die Prävalenz des Entertoxin-Gens von S. aureus, welche durch die PCR-Methode ermittelt wurde, zeigte, dass der größte Teil der Isolate für mehr als ein Enterotoxin-Gen positiv war. Andere Isolate besaßen kein Enterotoxin-Gen. Außerdem zeigten die S. aureus-Isolate neun verschiedene enterotoxische Profile. Von den Sequenz-Typen der bovinen Mastitis-Milch gehörte ein Großteil zu den „clonal complex“ CC5, CC97, CC133 und CC151. Dieses zeigte ein enge Verbindung zu den Genotypen oder Abstammungslinien von den Sequenz-Typen menschlicher Herkunft. Die genotypische Charakterisierung von S. aureus, welches aus boviner Mastitismilch isoliert wurde und mittels MLST und spa-typing ermittelt wurde, zeigte, dass die Infektionen in den Kuhherden aus verschiedenen Regionen in Norddeutschland durch zahlreiche Klone verursacht wurden. Diese Klone waren eng mit anderen Stämmen aus verschiedenen Regionen der Welt verwandt. Die Identifizierung von neuen STs und neuen spa-Typen in einigen Isolaten, unterstreicht die Wichtigkeit solcher Studien in Kühen, da sich die Hinweise auf eine direkte Übertragung von S. aureus zwischen Milchkühen und Menschen häufen. Die in der vorliegenden Studie entwickelten minimal aufspannenden Bäume unterstützen diese Annahme und eröffnen neue Möglichkeiten, tierische und menschliche Stämme unter epidemiologischen Gesichtspunkten zu verbinden.

abstract (englisch)

The LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) assay is regarded as one of the most efficient methods in detecting human and animal pathogens, because it can amplify DNA with high efficiency, specificity, and more quickly under isothermal conditions. S. aureus is one of the most important pathogens affecting humans and animals alike. In dairy cattle, mastitis caused by S. aureus represents an important economical factor, and herd management regarding udder health depends on quick and correct pathogen identification. The present study consisted of two main parts: First, development and validation of a new LAMP assay for detecting S. aureus, and second, phenotypical and genotypical characterization of S. aureus from milk mastitis.

Loop-mediated isothermal amplification is a powerful, innovative gene amplification method which is regarded as an easy to perform, rapid diagnostic tool with more specificity and more sensitivity for detecting and identifying pathogens. In the present study, a LAMP assay based on gene nuc to identify S. aureus was developed and validated. The specificity of the LAMP assay was confirmed by using 70 S. aureus isolates collected from bovine mastitis milk samples during the period from August 2001 to March 2014 in different regions of Northern Germany and 21 non-S. aureus strains. The results of the LAMP assays enabled the detection of gene nuc in all investigated S. aureus isolates (100%), while no signal was detected with any of the non-S. aureus strains tested. The analytical sensitivity of the developed LAMP assay amounted to 0.26 pg of S. aureus DNA per reaction. The limit of detection evaluated with milk spiked with S. aureus was 9×102 CFU mL-1.  The developed LAMP assay is a rapid detection method for identifying S. aureus with high specificity and sensitivity. The use of a real-time fluorometer enabled S. aureus to be identified in less than two hours including the DNA preparation. Therefore, this assay is a rapid, flexible and simple tool for identifying S. aureus isolates.control dairy herds were investigated. The real-time PCR showed MAP positive results for 11 (18.96%) and 6 (17.14%) of the case and control herds, respectively. The odds ratio for the association between MAP-positive PCR results from milk and fecal To understand the molecular ecology of S. aureus, the present study compared phenotypical and genotypical characteristics of 70 S. aureus isolates. All S. aureus isolates were characterised phenotypically, as well as for their genetic diversity using multilocus sequence typing (MLST), staphylococcal protein A (spa) typing, and for the presence of virulence genes encoding 16 staphylococcal enterotoxins (sea-selu), toxic shock syndrome toxin (tst), thermonuclease (nuc), clumping factor (clfA and clfB), coagulase (coa), and the methicillin resistance gene mecA. Additionally, the present study was carried out to show a relationship between S. aureus isolates in this study with the profile of 118 human strains isolated in Germany and the profile of 33 strains of S. aureus from bovine mastitis from different European countries.

The staphaurex (clumping factor and protein A) test revealed that 75.7% of the isolates were positive, while all investigated isolates were positive for the catalase test. The API 32 Staph identification system confirmed that all isolates were S. aureus. According to the antimicrobial susceptibility testing, all S. aureus investigated isolates were methicillin sensitive (MSSA), whereas the isolates showed a high resistance rate to penicillin and ampicillin.

By means of MLST analysis, sixteen different sequence types (ST) were determined. From these, six were novel STs which were designated as ST2821, ST2823, ST2824, ST2825, ST2826, and ST2827. A total of 16 sequence types were grouped into eight clonal complexes (CCs). Seventeen different spa types were identified. One new spa type (t13769) was found. The prevalence of enterotoxin genes of S. aureus obtained by PCR revealed that most of the isolates were positive for more than one of the enterotoxin genes,while other isolates did not possess any enterotoxin genes. In addition, the S. aureus isolates displayed nine different enterotoxigenic profiles. The majority of bovine mastitis milk-associated sequence types belonged to the clonal complexes CC5, CC97, CC133 and CC151 which showed closely related genotypes or lineages with sequence types of human origin. The genotypical characterization of S. aureus isolated from bovine mastitis milk by MLST and spa typing showed that the infections in cow herds of different regions in Northern Germany were caused by numerous clones related to those previously circulating in various regions of the world. The identification of novel STs and novel spa types in some isolates highlights all the more the importance of this type of study in cows, since there is growing evidence of a direct transmission of S. aureus between dairy cows and humans. The minimum spanning trees developed in this study support this evidence, providing new possibilities of linking human and animal strains from an epidemiological point of view.

keywords

Staphylococcus aureus, boviner Mastitismilch, Norddeutschland, bovine mastitis, Northern Germany

kb

15.662