Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Diana Seinige

Untersuchungen zur Eignung der interkalierenden Substanzen Ethidiummonoazid und Propidiummonoazid für eine quantitative Bestimmung lebender Campylobacter-Zellen aus Lebensmittelproben und Wasser mittels real-time PCR

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105943

title (engl.)

Investigation of the suitability of the intercalating dyes ethidium monoazide and propidium monoazide for a quantitative detection of viable Campylobacter-cells in food samples and water by real-time PCR

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/seiniged_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Campylobacter (C.) spp. sind europaweit die häufigsten bakteriellen Lebensmittel-infektionserreger und verursachen gastrointestinale Infektionen beim Menschen. Dabei werden jährlich steigende Fallzahlen berichtet. Als überwiegende Infektionsquelle gilt kontaminiertes Geflügelfleisch, aber auch kontaminiertes Trink- und Oberflächenwasser stellen eine zunehmend wichtige Quelle für humane Infektionen mit Campylobacter spp. dar. Daher ist eine schnelle und zuverlässige Diagnostikmethode zur Detektion von Campylobacter spp. dringend erforderlich. Die fehlende Differenzierung von lebenden und somit potentiell infektiösen Zellen von toten Zellen limitiert aber die Anwendung der quantitativen real-time PCR (qPCR) in der Routinediagnostik an Lebensmittelproben. In jüngster Zeit wurde deshalb die qPCR in Kombination mit DNA-interkalierenden Substanzen, wie Ethidiummonoazid (EMA) und Propidiummonoazid (PMA), eingesetzt, um eine Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen zu ermöglichen. Diese Substanzen dringen in membrangeschädigte Zellen ein und verhindern durch ihre Bindung an die zelluläre DNA eine Amplifikation dieser DNA in der anschließenden PCR.

Ziel der vorliegenden Studie war es, ein qPCR-basiertes Nachweisverfahren in Kombination mit einer interkalierenden Substanz für thermotolerante Campylobacter spp. zu etablieren, welches einen schnellen quantitativen Erregernachweis ermöglicht. Zudem sollte die Eignung der Methode an Proben verschiedener Lebensmittelmatrices, wie Geflügelfleisch und Wasser, getestet werden.

In den ersten Versuchsreihen wurde eine qPCR Methode zum Nachweis thermotoleranter Campylobacter-Zellen etabliert. Dafür wurde eine Standardkurve zur Berechnung der Keimkonzentration in einer Probe erstellt. Bei dieser Standardkurve konnte eine hohe Korrelation zwischen den aus Ct-Werten der qPCR errechneten Keimgehalten und den eingesetzten Keimkonzentrationen ermittelt werden. Zudem wurde eine hohe PCR-Effizienz von 98,9% errechnet. In einem nächsten Schritt wurde der Einfluss der interkalierenden Substanzen EMA und PMA in unterschiedlichen Konzentrationen getestet. Dabei konnte sowohl bei Verwendung von EMA als auch von PMA eine konzentrationsabhängige Verschiebung der Detektionskurve mit höheren Ct-Werten in der qPCR beobachtet werden. Aufgrund dieser Verschiebung wurde die Standardkurve auf die Versuchsbedingungen angepasst und mittels einer Vorbehandlung der Zellen mit EMA oder PMA erstellt. Diese neu erstellte Standardkurve wurde erstmalig zusammen mit einem internen DNA-Standard für die Berechnung der Keimkonzentrationen verwendet. Dabei konnten hohe Korrelationen zur mikrobiologischen Referenzmethode erzielt werden. Anschließend wurde die Differenzierungskraft der interkalierenden Substanzen bei Gemischen aus lebenden und toten Zellen getestet. In diesen Versuchsreihen zeigten EMA (10 µg/ml) und PMA (51,10 µg/ml) eine gute Eignung zur Differenzierung lebender von toten Zellen bei bis zu 1:1000 lebenden zu toten Zellen in den Gemischen. In weiteren Versuchsreihen wurde die Signalreduktion in der qPCR bei einer Vorbehandlung von hitzeinaktivierten Zellen mit den interkalierenden Substanzen untersucht. Bei einer hohen Konzentration an toten Zellen (>104 KbE/ml) war eine unvollständige Signalreduktion zu beobachten. Um diese Limitierung zu umgehen wurde erstmalig eine Doppelbehandlung der Campylobacter spp.-Zellen mit EMA (10 µg/ml) durchgeführt. Dabei konnten die Resultate deutlich verbessert werden, so dass eine ausreichende Signalreduktion bei bis zu 106 KbE/ml an toten Zellen erzielt wurde. Das erstellte EMA-qPCR Protokoll wurde in weiteren Versuchsreihen an C. jejuni- und C. coli-Feldisolaten erfolgreich getestet. Dabei konnte eine hohe Korrelation zwischen den Resultaten der qPCR und der mikrobiologischen Referenzmethode ermittelt werden. Die etablierte EMA-qPCR Methode wurde nachfolgend für die Anwendung an Proben der Lebensmittelmatrix Geflügelfleisch getestet. Dafür wurden verschiedene Versuchsreihen mit gespikten Hühnerfleischproben angeschlossen, bei welchen die EMA-qPCR Methode eine sehr gute Eignung zur Detektion lebender Campylobacter-Zellen zeigte. Dabei konnte eine hohe Übereinstimmung der Ergebnisse aus der EMA-qPCR und der mikrobiologischen Keimzählung ermittelt und durch eine Methodenvergleichsuntersuchung mittels einer Bland-Altman Analyse bestätigt werden. Zur Testung der Methode bei Wasserproben wurden in einem ersten Schritt zwei Reisolierungsmethoden vergleichend untersucht (Membranfiltration, Zentrifugation). Bei beiden Methoden kam es zu einem Keimverlust nach der Zentrifugation oder der Membranfiltration und die prozentualen Anteile lebender und toter Zellen verschoben sich zugunsten der lebenden Zellen. In weiteren Versuchsreihen wurden die Reisolierungsmethoden in Kombination mit der qPCR Methode getestet. Bei Filtration der Proben konnte eine hohe Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen der qPCR und der EMA-qPCR im Vergleich zur kulturellen Keimzählung ermittelt werden. Im Gegensatz dazu war bei der Zentrifugation ein höherer Keimgehalt in der qPCR ohne EMA zu detektieren. Der Einfluss von verschiedenen Wasserarten auf die Ergebnisse der qPCR wurde in anschließenden Versuchen ermittelt. Dabei wurde in Oberflächenwasser eine hohe Anzahl an toten Zellen detektiert, so dass mittels der EMA-qPCR keine korrekte Bestimmung lebender Zellen möglich war. Bei Verwendung von Leitungswasser, Regenwasser oder Mineralwasser konnten hohe Korrelationskoeffizienten zwischen den Ergebnissen der EMA-qPCR und der mikrobiologischen Keimzählung ermittelt werden. Die Eignung der Methode für diese Wasserarten wurde in einer Methodenvergleichsuntersuchung mittels Bland-Altman Analyse bestätigt. Die Anwendung der Methode bei Campylobacter-Feldisolaten erzielte eine hohe Übereinstimmung zur mikrobiologisch ermittelten Keimkonzentration. Die Überlegenheit der EMA-qPCR Methode konnte zudem an definierten Gemischen aus lebenden und toten Zellen bestätigt werden.

Sowohl bei Geflügelfleisch als auch bei Wasserproben zeigte sich die EMA-qPCR Methode als vielversprechend zur Detektion lebender Campylobacter-Zellen. Aufgrund der aufgezeigten Limitierungen sollte eine weitere Validierung der Methode durchgeführt werden.

abstract (englisch)

In Europe, Campylobacter (C.) spp. are the most common bacterial food-borne pathogens. Campylobacter spp. are the causative agents of gastrointestinal infections in humans and increasing annual numbers of cases are reported. The predominant source of infection is poultry meat, however contaminated drinking- and surface water are also important sources of human infections with Campylobacter spp. Hence, a fast and reliable diagnostic method for the detection of Campylobacter spp. is urgently required. The lack of differentiation between viable and potentially infectious cells from nonviable cells limits the implementation of quantitative real-time PCR (qPCR) methods in routine diagnostic analysis of food samples. Recently, combinations of qPCR assays and ethidium monoazide (EMA) or propidium monoazide (PMA) pretreatments of cells have been proposed to achieve a differentiation between viable and nonviable cells. EMA and PMA penetrate membrane damaged cells and bind to cellular DNA, preventing the amplification of DNA in subsequent qPCR experiments.

 

The aim of the present study was to develop a qPCR based detection method in combination with the use of an intercalating dye for a rapid quantitative detection of thermotolerant Campylobacter spp. In addition, the applicability of the method for different food matrices, such as poultry meat and water was determined.

 

In the first series of experiments, a qPCR method for the detection of thermotolerant Campylobacter was used. For this, a standard curve was generated for calculating the quantities of CFU in a sample. By using this standard curve a high correlation between the amount of Campylobacter spp. calculated from qPCR results and microbiological cell enumeration was determined. The PCR efficiency corresponded to 98.9%. In a subsequent step, the influence of the intercalating dyes EMA and PMA on qPCR results was determined. For this, EMA and PMA were tested at different concentrations. Results from qPCR experiments revealed concentration dependent shifts towards higher Ct-values after application of the intercalating dyes EMA and PMA. Therefore, the standard curve was adapted to the experimental conditions and Campylobacter-cells were pretreated with PMA or EMA. This adapted standard curve was used together with an internal DNA standard for quantifying Campylobacter from food samples. A high correlation coefficient value was achieved from a plot of log10 cell counts determined by qPCR and culture enumeration. In a subsequent step, the suitability of the intercalating dyes for differentiating between viable and nonviable cells was tested in mixtures of live and heat-killed cells. EMA (10 µg/ml) and PMA (51.10 µg/ml) removed DNA selectively from nonviable cells in mixed samples. Furthermore, heat-killed cells were pretreated with the intercalating dyes and the signal reduction in qPCR experiments was determined. At high concentrations of dead cells (>104 CFU/ml), an incomplete signal reduction was observed. To circumvent this limitation, a double staining of EMA (10 µg/ml) was performed and clearly improved the signal reduction of nonviable Campylobacter-cells, if a limit of 106 CFU/ml was not exceeded. In further experiments the EMA-qPCR protocol was successfully applied to C. jejuni and C. coli field isolates. A high correlation coefficient value between the results of qPCR and the microbiological reference method was calculated. The suitability of the EMA-qPCR method was subsequently tested by using chicken meat samples. For this, chicken meat samples were spiked with different quantities of Campylobacter. There was a linear relationship between results from EMA-qPCR and the microbiological reference method and a method comparison by Bland-Altman analysis showed a low variation between the methods.

 

In further experiments the suitability of the method was tested for water samples. For this, two methods frequently used for the isolation of bacteria were comparatively analyzed (membrane filtration, centrifugation). The application of both methods resulted in a loss of Campylobacter-cells and an accumulation of viable cells in the samples. After recovery of cells by membrane filtration and centrifugation, the qPCR method with and without EMA was used. After filtration of samples, a high agreement between results of qPCR, EMA-qPCR and the microbiological enumeration was achieved. In contrast, after centrifugation of samples, qPCR without EMA overestimated the quantities of Campylobacter CFU/ml. In subsequent experiments, the influence of different types of water on the results of qPCR was determined. A high percentage of dead cells was detected in surface water by fluorescence microscopy, resulting in an incorrect determination of viable cells by EMA-qPCR. In contrast, results from tap water, rain water or mineral water samples revealed high correlation coefficient values between results from EMA-qPCR and the microbiological cell enumeration. The suitability of EMA-qPCR for analysis of these types of water samples was confirmed by Bland-Altman analysis. In addition, field isolates were subjected to EMA-qPCR quantification and a high correlation coefficient value between results from EMA-qPCR and culture enumeration was achieved. However, when defined mixtures of viable and nonviable cells were used, an advantage of the EMA-qPCR method over qPCR without EMA pretreatment was detected.

 

In conclusion, EMA-qPCR seems to be a promising method for the detection of viable Campylobacter-cells from chicken meat and water samples but further studies are needed to overcome the limitations.

keywords

Campylobacter, real-time PCR, EMA und PMA / Campylobacter, real-time PCR, EMA and PMA 

kb

1.143