Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Jana Seele

Identification and functional characterization of IdeSsuis, the

Immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis.

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106909

title (ger.)

Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von IdeSsuis, dem Immunglobulin M-spaltenden Enzym von Streptococcus suis.

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/seelej_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Streptococcus (S.) suis ist ein wichtiger invasiver, extrazellulärer Erreger des Schweins, der hauptsächlich Meningitis, Arthritis und Serositis verursacht. Des Weiteren stellt S. suis einen wichtigen Zoonoseerreger dar, der beim Menschen vor allem Meningitis hervorruft. In Europa ist bisher kein Impfstoff gegen S. suis-Infektionen zugelassen. S. suis-Erkrankungen treten häufig 6-10 Wochen post partum auf. In dieser Zeit besitzen Ferkel in der Regel hohe S. suis-spezifische IgM-Titer.

Die vorliegende Arbeit wurde durch die Detektion von Immunglobulin M-(IgM)-Spaltprodukten im Überstand serumopsonisierter S. suis initiiert. IgM ist die erste Antikörperklasse, die nach Stimulation mit einem Antigen produziert wird, und stellt die Hauptklasse der natürlichen Antikörper dar. Es besitzt wichtige Funktionen einschließlich der Neutralisierung von Pathogenen/Toxinen, der Aktivierung des klassischen Komplementweges (CP) und der Verstärkung humoraler Immunantworten. Die vorliegende Arbeit wurde konzipiert, um die Pathogenese von S. suis-Infektionen in Ferkeln während der frühen adaptiven Immunantwort zu untersuchen. Die Ziele bestanden in der Identifizierung und Charakterisierung des IgM-spaltenden Faktors von S. suis (Chapter 3). Nach erfolgreicher Identifizierung von IdeSsuis, dem Immunglobulin M-spaltenden Enzym, wurde die Hypothese untersucht, dass IdeSsuis in der Komplementevasion von S. suis beteiligt ist (Chapter 4). Schließlich wurden die Immunogenität sowie die Schutzwirkung eines rekombinanten (r) IdeSsuis-Impfstoffes bestimmt (Chapter 5).

Sequenzvergleiche zeigten, dass S. suis ein Gen besitzt, das große Homologien zum IgG-spaltenden Enzym von S. pyogenes (IdeS) aufweist. Durch funktionelle Analyse wurde bewiesen, dass rIdeSsuis eine spezifische IgM-proteolytische Aktivität besitzt, aber nicht IgG und IgA spaltet. Loss and gain of function experiments zeigten unter Verwendung verschiedener isogener S. suis- und Lactococcus (L.) lactis-Mutanten, dass die Expression von IdeSsuis verantwortlich und ausreichend für die Spaltung von IgM ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Bindung von IgM an die Oberfläche von S. suis durch die Expression von IdeSsuis moduliert wird. Western Blot-Analysen bewiesen, dass IdeSsuis ausschließlich porzine IgM, nicht jedoch die IgM sechs weiterer untersuchter Spezies spaltet.

Mittels N-terminaler Edman-Sequenzierung konnte die Schnittstelle im IgM-Molekül im N-terminalen Bereich der konstanten Domäne 3 (Cμ3) identifiziert werden. Da das C1q-Bindungsmotiv in Cμ3 lokalisiert ist und durch die IdeSsuis-vermittelte IgM-Spaltung vom Fab-Bereich getrennt wird, wurde die Hypothese aufgestellt, dass IdeSsuis den klassischen Weg der Komplementaktivierung außer Kraft setzt. IdeSsuis reduzierte, entsprechend der Hypothese, die Aktivierung des CP in einem Komplement-Hämolyse-Versuch unter Verwendung spezifischer porziner Antiseren. Des Weiteren war in Abwesenheit von IdeSsuis die IgM-vermittelte C3-Ablagerung auf der Oberfläche eines unbekapselten Stammes signifikant erhöht. Die vergleichende Analyse der Virulenz des S. suis-Wildtypstammes und einer isogenen ideSsuis-Mutante in Ferkeln deutete auf eine Attenuation der Mutante hin. Im Einklang mit diesen Ergebnissen zeigte die ideSsuis-Mutante eine signifikante Attenuation im Überleben in porzinem Blut mit hohen S. suis-spezifischen IgM-Titern auf.

Die Feststellung, dass die IgM-spaltende Aktivität von IdeSsuis durch IdeSsuis-spezifische Antikörper neutralisiert wird, veranlasste weitere Untersuchungen zur Immunogenität und Schutzwirkung eines rIdeSsuis-Impfstoffes. Vor der Immunisierung wiesen die Ferkel keine detektierbaren IdeSsuis-spezifischen Antikörpertiter auf, obwohl ihre mukosalen Oberflächen mit IdeSsuis-exprimierenden S. suis-Stämmen besiedelt waren. Die Vakzinierung von Ferkeln mit rIdeSsuis rief hohe Titer IdeSsuis-neutralisierender Antikörper hervor und, besonders bedeutsam, einen vollständigen Schutz gegen Mortalität und Morbidität. Das Überleben des Wildtypstammes ex vivo in porzinem Blut IdeSsuis-vakzinierter Ferkel war dementsprechend signifikant reduziert, im Gegensatz zum Überleben der ideSsuis-Mutante. Da alle getesteten S. suis-Stämme IdeSsuis exprimieren, wird die Schutzwirkung des IdeSsuis-Impfstoffes gegen Infektionen anderer S. suis-Serotypen in zukünftigen Vakzinierungsversuchen untersucht, die durch diese Arbeit initiiert wurden.

Zusammenfassend wurde gezeigt, dass IdeSsuis (i) die erste spezifische prokaryotische IgM-Protease ist, (ii) einen neuen Komplementevasionsfaktor darstellt, der zum bakteriellen Überleben im porzinen Blut mit hohen spezifischen IgM-Titern beiträgt und (iii) ein protektives Antigen ist, dass neutralisierende Antikörper und eine signifikante Protektion gegen S. suis-Serotyp-2-Infektionen hervorruft.

abstract (englisch)

Streptococcus (S.) suis is an important invasive, extracellular pathogen in pigs, which causes mainly meningitis, arthritis and serositis. Furthermore, serotype 2 strains are important zoonotic agents associated with meningitis in humans. So far no vaccine against S. suis infections is licensed in Europe. S. suis disease occurs most often in piglets 6-10 weeks postpartum and these animals typically show S. suis-specific IgM titers.

This study was initiated by the finding that serum-opsonized S. suis released immunoglobulin M (IgM) cleavage products into the supernatant. IgM is the first antibody class produced after antigenic stimulation and represents the main class of natural antibodies. It harbors different important functions including neutralization of pathogens/toxins, activation of the classical complement activation pathway (CP) and enhancement of humoral immune responses. This study was designed to better understand the pathogenesis of S. suis infections in piglets during their early adaptive immune response. The objectives of this work were the identification and characterization of the factor responsible for IgM cleavage (Chapter 3). After successful identification of IdeSsuis, the Immunoglobulin M-degrading enzyme of S. suis, the hypothesis was investigated that IdeSsuis is involved in complement evasion of S. suis (Chapter 4). Finally, the immunogenicity and protective efficacy of a recombinant (r) IdeSsuis vaccine were determined (Chapter 5).

Sequence alignments revealed that S. suis harbors a gene with high homology to the IgG-degrading enzyme of S. pyogenes (IdeS). Functional analysis of rIdeSsuis demonstrated an IgM-specific proteolytic activity for this factor lacking IgG- and IgA-degrading activity. Loss and gain of function experiments using different isogenic S. suis and Lactococcus (L.) lactis mutants allowed the conclusion that expression of IdeSsuis is responsible and sufficient for IgM cleavage. Furthermore, it was shown that binding of IgM to the bacterial surface is modulated by IdeSsuis expression. Western blot analysis revealed that IdeSsuis cleaves only IgM of pigs but not IgM of the other six investigated species.

Via N-terminal Edman-sequencing the cleavage site in the IgM molecule was identified at the N-terminus of constant domain 3 (Cμ3). As the C1q-binding motif is located in Cμ3 and disconnected from the antigen-binding Fab-part through IgM cleavage by IdeSsuis, the hypothesis was investigated that IdeSsuis abrogates the CP. Accordingly, IdeSsuis reduced activation of the CP in a complement hemolysis assay including specific porcine anti-sera. Furthermore, IgM-triggered C3 deposition on the surface of an unencapsulated strain was significantly increased in the absence of IdeSsuis. Comparative evaluation of virulence of S. suis wild type (wt) and the isogenic ideSsuis mutant in piglets suggested an attenuation of the mutant. Accordingly, the ideSsuis mutant was significantly attenuated in survival in porcine blood with high titers of S. suis-specific IgM.

The finding that the IgM-cleaving activity of IdeSsuis is neutralized by IdeSsuis-specific antibodies promoted further investigation of the immunogenicity and protective efficacy of rIdeSsuis vaccination. Piglets did not show detectable IdeSsuis-specific antibody titers prior immunization, although their mucosal surfaces were colonized by S. suis strains expressing IdeSsuis. Vaccination of piglets with rIdeSsuis elicited high titers of antibodies neutralizing IdeSsuis and, importantly, complete protection against mortality and severe morbidity. Accordingly, a bactericidal assay revealed that survival of the wt strain in porcine blood ex vivo is significantly reduced in IdeSsuis-vaccinated piglets, in contrast to survival of the ideSsuis mutant. As all tested S. suis strains express IdeSsuis the protective efficacy of the rIdeSsuis vaccine against infections with other S. suis serotypes will be investigated in future vaccination trials initiated by this thesis.

In conclusion, IdeSsuis was shown to be (i) the first specific prokaryotic IgM protease, (ii) a novel complement evasion factor contributing to bacterial survival in porcine blood with high titers of specific IgM and (iii) a protective antigen eliciting neutralizing antibodies and significant protection against S. suis serotype 2 infections.

keywords

Streptococcus suis, IgM, Komplement, complement 

kb

1.151