Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Bettina Seeger

Risk assessment of hormonally active pesticide residue mixtures

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108538

title (ger.)

Risikobewertung von hormonell aktiven Pflanzenschutzmittel-Gemischen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/seegerb_ss16.pdf

abstract (deutsch)

In der Europäischen Union (EU) sind etwa ein Drittel der konventionell angebauten Früchte, Gemüse und anderer Gartenbauerzeugnisse mit Mehrfachrückständen von Pflanzenschutzmitteln belastet. Bisher basiert die Risikobewertung von Pflanzenschutzmitteln auf einer Einzelstoffbewertung. Deshalb werden Rückstandshöchstgehalte (Maximum Residue Levels, MRLs), die gesetzlich festgelegten Höchstmengen von Pestizidrückständen in oder auf Lebensmitteln, für einzelne Pestizide bestimmt. Da diese gesetzlich festgelegten Grenzwerte zumeist nicht überschritten werden, wird im Allgemeinen angenommen, dass der Konsum dieser Lebensmittel sicher sei.

Viele Pflanzenschutzmittel können mit dem humanen Hormonsystem interagieren, beispielsweise durch Aktivierung des humanen Estrogenrezeptors α (hERα) und/oder des humanen Estrogenrezeptors β (hERβ) oder durch Inhibition des humanen Androgenrezeptors (hAR). Wissenschaftliche Erkenntnisse weisen darauf hin, dass estrogen und anti-androgen wirksame Chemikalien einen schädlichen Einfluss auf die menschliche Gesundheit haben könnten. In den letzten Jahren haben insbesondere Studien zu Mischungen estrogener oder anti-androgener Umweltchemikalien Aufmerksamkeit erweckt, da sie gezeigt haben, dass diese signifikante Effekte hervorrufen können, selbst wenn die Einzelstoffe unterhalb ihrer individuellen No Observed Effect Concentrations (NOECs) eingesetzt worden sind. Es wird angenommen, dass Pestizid-Gemische, die Substanzen enthalten, die einen bestimmten Wirkmechanismus (mode of action, MOA) teilen, additiv wirken. Dies wirft wiederum die Frage auf, ob die aktuell angewendete Einzelstoffbewertung ausreichend ist, um die Risiken chemischer Mischungen zu bewerten. Die gängige Praxis, wie Pflanzenschutzmitteln in der konventionellen Lebensmittelerzeugung angewendet werden, und experimentelle Daten deuten auf die Notwendigkeit eines kumulativen Risikobewertungsansatzes hin. Dieser Ansatz wird momentan vom Gremium für Pflanzenschutz, Pflanzenschutzmittel und ihre Rückstände (PPR, Panel on Plant Protection Products and their Residues) der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA, European Food Safety Authority) evaluiert. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit in vitro Reportergen-Assays zur Bewertung estrogen und anti-androgen aktiver Pflanzenschutzmittelrückstände und deren Mischungen im Rahmen einer kumulativen Risikobewertung geeignet sind.

Es wurden zwei häufig verwendete in vitro Reportergen-Assay-Systeme genutzt, um estrogene oder anti-androgene Effekte diverser Pestizide zu testen. Eines dieser Testsysteme ist Hefe-basiert, das andere Humanzell-basiert. Acht Pestizide (Pirimicarb, Propamocarb, Fenarimol, Chlorpyrifos, Fenhexamid, Fludioxonil, 2,4’-DDT und 4,4’-DDT) wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die humanen Estrogenrezeptoren zu aktivieren (hERα: Yeast-based Estrogen Screen [YES] Assay und ERα chemical-activated luciferase gene expression [CALUX] Assay; hERβ: ERβ CALUX Assay), wohingegen sechs Pestizide (Procymidon, Vinclozolin, Tebuconazol, Propiconazol, Fenarimol und Prochloraz) auf ihre anti-androgene Wirkung am hAR getestet worden sind (Yeast-based Androgen Screen [YAS] Assay und AR CALUX Assay). Die Interaktion der Substanzen mit den Rezeptoren kann auf diese

Weise quantifiziert und somit der Grad ihrer Wirkung am Rezeptor geschätzt werden. Das Ziel war es, die für Einzelstoffe validierten Testsysteme zu nutzen, um Effekte von Pestizidmischungen zu

beurteilen. Dafür wurden Pestizide, die einen gemeinsamen MOA haben, in Verhältnissen gemischt, die auf Konzentrationen der Einzelstoffe beruhen, die den gleichen Effekt hervorrufen, bezogen auf einen spezifischen Endpunkt (iso-effektive Mischungen) und in den jeweiligen Bioassays getestet. Die Mischungen von Pestiziden mit estrogener Wirkung basierten dabei auf niedrigen Effektkonzentrationen der Einzelstoffe. Bei diesen Konzentrationen handelt es sich um EC01- und EC10-Werte, die Konzentrationen der Einzelsubstanzen, die im Verhältnis zum natürlichen Liganden 17β-Estradiol (E2) einen 1 oder 10%igen Effekt hervorrufen, wohingegen die Mischungen der Pestizide mit anti-androgener Wirkung auf niedrigen inhibitorischen Konzentrationen, den IC01- und IC10-Werten, beruhen. In diesem Fall handelt es sich um die Konzentrationen der Einzelsubstanzen, die eine 1 oder 10%ige Hemmung des Effekts des natürlichen Liganden Dihydrotestosteron (DHT) am hAR hervorrufen. Diese niedrigen Effekt-/inhibitorischen Konzentrationen sind gewählt worden, um präzise Daten im niedrigen, humanrelevanten Konzentrationsbereich zu erhalten. Um nachzuweisen, ob es sich um additive Mischungseffekte handelt oder ob Abweichungen im Sinne synergistischer oder subadditiver Effekte vorliegen, müssen die experimentell gewonnenen Daten mit Daten aus einer mathematischen Modellierung für Additivität verglichen werden. Deshalb wurde das Modell der Konzentrations-Additivität (concentration addition, CA) genutzt, welches für Substanzen, die einen MOA teilen, als Standardmodell angenommen werden kann.

Mit den genutzten Testsystemen konnten sowohl estrogene Effekt am hERα und am hERβ als auch anti-androgene Effekte am hAR zuverlässig identifiziert werden. Pirimicarb zeigte in beiden Testsystemen keine estrogene Aktivität, weder am hERα noch am hERβ. Im Gegensatz dazu hat Propamocarb den hERα und den hERβ in den CALUX-Assays, jedoch nicht den hERα im YES Assay aktiviert. Anti-androgene Effekte konnten für alle Substanzen im YAS Assay sowie im AR CALUX nachgewiesen werden, mit Ausnahme der Triazole Propiconazol und Tebuconazol, die negativen Einfluss auf das Wachstum der Hefezellen hatten. Alle genutzten Testsysteme sind geeignet, sowohl estrogene als auch anti-androgene Effekte an den jeweiligen Steroidrezeptoren zu identifizieren und können daher zur Sammlung mechanistischer Daten von Pestiziden beitragen, welche wiederum im Gefahrenermittlungsschritt (hazard identification) der Risikobewertung hormonell aktiver Pflanzenschutzmittel genutzt werden könnte.

Außerdem war es mit den genutzten Testsysteme möglich, additive Effekte in niedrigen Effekt-/inhibitorischen Konzentrationen estrogen und anti-androgen wirkender Pestizide nachzuweisen, da die experimentellen Daten mit den Vorhersagen, die mithilfe von CA gemacht worden sind, übereinstimmten. Die hier vorliegenden Ergebnisse unterstützen die generelle Annahme additiver Effekte von Pestiziden mit einem gemeinsamen MOA und damit ebenso die allgemeine Anwendbarkeit von CA. Insgesamt sprechen die erzielten Ergebnisse dafür, dass die zwei in vitro-Testsysteme zur Risikobewertung von Mischungen hormonell aktiver Pflanzenschutzmittelrückstände, die einen gemeinsamen MOA haben, beitragen können.

 

abstract (englisch)

About one third of conventionally cultured fruits, vegetables and other crops in the European Union (EU) contains multiple pesticide residues. At present, risk assessment of pesticides is based on the evaluation of single substances. Consequently Maximum Residue Levels (MRLs), the upper statutory limits of concentrations of pesticide residues in or on food, are determined for those single pesticides. Since these legal thresholds are mostly not exceeded, the impression is given that the consumption of foodstuffs is generally safe.

Many pesticides are able to interfere with the human endocrine system, e.g. by activating the human estrogen receptor α (hERα) and/or the human estrogen receptor β (hERβ) or by inhibiting the human androgen receptor (hAR). There is scientific evidence that estrogenic and anti-androgenic acting substances could be associated with adverse health effects in humans. In recent years, particularly studies on mixtures of estrogenic and anti-androgenic environmental chemicals attracted attention, since it was reported that they induce significant effects, even when the individual substances were applied below their No Observed Effect Concentrations (NOECs). Pesticide mixtures, which contain substances sharing the same mode of action (MOA), are assumed to act additively. This issue raises the question whether the evaluation of individual substances is adequate to estimate the risks emanating from mixtures. The way in which pesticides are applied in conventional food production and experimental results demonstrate that a cumulative risk assessment approach is needed. This approach is currently being evaluated by the European Food Safety Authority (EFSA) Panel on Plant Protection Products and their Residues (PPR). Therefore, it was investigated whether in vitro reporter gene bioassays are suited to contribute to the evaluation of estrogenically and anti-androgenically acting pesticide residues and their mixtures in conjunction with cumulative risk assessment.

Two commonly used in vitro reporter gene bioassay systems were used to evaluate their ability to detect estrogenic or anti-androgenic effects of various pesticides. One system is based on yeast cells and the other one on human cells. Eight pesticides (pirimicarb, propamocarb, fenarimol, chlorpyrifos, fenhexamid, fludioxonil, 2,4’-DDT and 4,4’-DDT) were tested regarding their potential to activate the human estrogen receptors (hERα: Yeast-based Estrogen Screen [YES] assay and ERα chemical-activated luciferase gene expression [CALUX] assay; hERβ: ERβ CALUX assay) and six pesticides (procymidone, vinclozolin, tebuconazole, propiconazole, fenarimol and prochloraz) regarding their potential to induce anti-androgenic effects at the hAR (Yeast-based Androgen Screen [YAS] assay and AR CALUX assay). The interaction of the substances can thereby be quantified and used to estimate the level of estrogenic and anti-androgenic effects at the respective receptors. The aim was to use the test systems validated for single compound analysis for the evaluation of mixture effects of pesticides. Therefore, pesticides sharing the same MOA were mixed at ratios based on concentrations at which they individually reveal the same effect on a specific reference endpoint (iso-effective mixtures) and were tested in the respective bioassays. The mixtures of substances with estrogenic activity were based on the low effect concentrations of the single substances. These concentrations are the EC01 and EC10 values, which are concentrations of the single substance causing a 1 or 10% effect normalized to the natural ligand 17β-estradiol (E2). The mixtures of substances that showed anti-androgenic effects were based on low inhibitory concentrations, i.e. IC01 and IC10. These concentrations are based on the amount of the test substance causing a 1 or 10% inhibition of the effect of the natural ligand dihydrotestosterone (DHT). These low effect/inhibitory concentrations were chosen to obtain precise data in a low, human-relevant concentration range. To verify whether the mixtures act additively or show deviations towards synergism or subadditivity, the data obtained from the experiments had to be compared to data obtained from mathematical modelling. Therefore, the mathematical model of concentration addition (CA) was applied, which is the model of choice for additive effects of chemicals sharing one MOA.

Via the used reporter gene bioassays it was possible to quantify the interaction of various pesticides with the hERα and hERβ as well as anti-androgenic effects at the hAR. Pirimicarb did not possess estrogenic activity in both test systems, neither at the hERα nor at the hERβ. In contrast, propamocarb activated the hERα and hERβ in the CALUX assays, but did not elicit an effect at the hERα in the YES assay. Anti-androgenic effects at the hAR could be confirmed for all test substances in the YAS assay as well as in the AR CALUX, with the exception of the triazoles propiconazole and tebuconazole, which negatively affected the growth of the yeast cells. All test systems are suited to identify estrogenic or anti-androgenic effects at the respective steroid receptors and could therefore contribute to the collection of mechanistic data of pesticides and further be used in the hazard identification step contributing to the risk assessment of hormonally active pesticides.

Furthermore, it was possible to show additive effects of low effect/inhibitory concentrations of estrogenic and anti-androgenic acting pesticides with the used test systems, since experimental data correlate with the predictions calculated by means of CA, supporting the necessity of a cumulative risk assessment approach. These results endorse the general assumption of additive behavior of pesticides sharing a MOA and therefore the applicability of CA. Taken together, the achieved results show that the two in vitro test systems may contribute to the risk assessment of hormonally active pesticide residue mixtures sharing the same MOA.

 

keywords

anti-androgen, estrogen, Pestizid-Gemische, anti-androgenic, estrogenic, pesticide residue mixtures

kb

4.297