Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Daniela Schwotzer

Investigations on the Toxicity of CeO2 Nanoparticles after Subchronic Inhalation of Low Doses

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-111611

titel (deu.)

Untersuchungen zur Toxizität von CeO2 Nanopartikeln nach subchronischer Inhalation im Niedrigdosisbereich

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2018

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/schwotzerd_ss18.pdf

abstract (deutsch)

Die vorliegende Dissertationsschrift beschreibt umfangreiche Untersuchungen zur Toxizität zweier Nanomaterialien: Ceroxid und Bariumsulfat. Ceroxid wird beispielsweise als Additiv in Dieselkraftstoff eingesetzt, da es aufgrund katalytischer Aktivitäten die Kraftstoffverbrennung verbessert. Bariumsulfat wird in einer Vielzahl an Produkten verarbeitet, darunter Farben und Beschichtungen. Das Forschungsprojekt basiert auf einer 90-Tage Inhalationstoxizitätsstudie nach OECD Test-Guideline (TG) 413. Initiiert wurde es in Ergänzung zu einer chronischen Inhalationstoxizitäts- und Kanzerogenitätsstudie mit CeO2 und BaSO4 Nanopartikeln gleicher Konzentrationen (BASF, Ludwigshafen; NANoREG program, 81|0661/10|170). Etwaige Untersuchungen zur subchronischen Exposition und der Vergleich zu Langzeiteffekten sind essentiell für eine adäquate Risikobewertung von Nanomaterial und unterstützen die bessere Differenzierung unterschiedlicher Materialien.

Der Fokus lag auf der Untersuchung der Exposition in Niedrigdosisbereich. Für CeO2 wurden daher folgende Konzentrationen getestet: 0,1, 0,3, 1,0 und 3,0 mg/m³. BaSO4 ist als chemisch inert und unbedenklich eingestuft und wurde in einer hohen Konzentration von 50.0 mg/m³ mitgeführt. Die Ratte diente als Testsystem. Die Tiere wurden für 1, 28 oder 90 Tage, 6 Stunden pro Tag und 5 Tage pro Woche exponiert. Zudem wurden Nachbeobachtungsphasen von 28 und 90 Tagen einbezogen.

Gemäß der OECD TG Vorgaben wurden Untersuchungen zur Retention, Hämatologie, Histopathologie sowie bronchoalveoläre Lavagen (BAL), durchgeführt. Diese konventionellen Endpunkte wurden durch umfangreiche Genexpressionsanalysen und immunhistochemische Untersuchungen erweitert. Diese Erweiterung sollte frühe Biomarker zur Prädiktion von Langzeiteffekten identifizieren sowie zur Aufklärung möglicher Wirkmechanismen beitragen. Die Durchführung der Genexpressionsanalysen in isolierten Typ II Alveolarepithelzellen (AEII Zellen) diente der Untersuchung des Beitrags zur zellulären Abwehr gegen die Nanopartikelexposition.

Die 90 Tage Exposition gegenüber 3,0 mg/m³ CeO2 Nanopartikeln führte zu verminderter Partikel-Clearance und Lungenüberladung („Overload“). Dies wurde begleitet von Entzündungsreaktionen im Alveolarbereich, nachgewiesen mittels histopathologischer Befunde, BAL und Genexpressionsanalyse. Die Genexpressionsanalysen und immunhistochemischen Untersuchungen lieferten außerdem Hinweise auf oxidativen Stress und Fibrose, durch Hochregulation der Marker Laktoperoxidase (Lpo) und Matrix-Metalloprotease 12 (Mmp12) in AEII Zellen. Die immunhistochemischen Analysen zeigten außerdem leicht erhöhte Zellproliferation und DNA Schädigung im Lungengewebe. Insbesondere die Entzündungsreaktion war persistent in der Nachbeobachtungsphase.  1,0 mg/m³ CeO2 verursachte ähnliche Effekte, jedoch in milderer Form. Die Werte zur Lungenüberladung lagen im Schwellenbereich. 0,3 mg/m³ CeO2 induzierte keinen Overload und nur leichte Hochregulation von Entzündungsmediatoren wie Il-1α und Il-1ß in AEII Zellen, während die Exposition gegenüber 0,1 mg/m³ CeO2 gar keine Effekte verursachte.

Des Weiteren wurde die Translokation von CeO2 in Leber und Niere sowie die Expression der gleichen Gene wie in den AEII Zellen (Entzündung, oxidativer Stress, DNA Schädigung, Apoptose) untersucht. Die in der Leber nachgewiesene partikuläre Cerium Menge lag unter 1%. Der Anstieg des Cerium-Gehalts über die Expositionszeit war signifikant. In der Niere wurden keine signifikanten Mengen partikulären Ceriums gemessen. Es ergaben sich leichte Hochregulationen einiger Entzündungsmarker in der Leber, die Ergebnisse waren insgesamt aber unauffällig.

BaSO4 zeigte eine sehr schnelle Elimination aus der Lunge. Es waren geringfügige histopathologische Veränderungen, hauptsächlich im Nasen-Rachenraum, messbar. Die Genregulation in AEII Zellen beschränkte sich auf erhöhte Lpo und Mmp12 Expression.

Die Ergebnisse der histopathologischen Untersuchungen und BAL Analysen zeigten sehr gute Übereinstimmungen zu den Genexpressionsmustern und deutliche Zeit- und Konzentrationsabhängigkeiten. Effekte in hohen Konzentrationen sind auf die bestehende Lungenüberladung zurückzuführen, während die Beobachtungen in niedrigeren Dosierungen auf Oberflächenaktivität der Partikel schließen lassen. AEII Zellen leisten einen signifikanten Beitrag zur Abwehr gegen Nanopartikel. Die histopathologischen Befunde, sowie die Hochregulation von Mmp12 weisen auf die Entwicklung von Fibrose hin. Basierend auf den generierten Ergebnissen konnte für CeO2 ein NOAEL von 0,41 mg/m³ ermittelt werden.

abstract (englisch)

The present research focused on the toxicology of nanomaterial. It was based on a 90-day inhalation toxicity study with cerium oxide and barium sulfate nanoparticles, performed according to OECD TG 413. CeO2 is for example used as diesel fuel additive. BaSO4 is used in paintings and coatings.

The project was an addition to a combined chronic inhalation toxicity and carcinogenicity study with CeO2 and BaSO4 (BASF, Ludwigshafen, Germany; NANoREG program, 81|0661/10|170). It aimed on investigating low dose nanoparticle exposure. Therefore, concentrations of 0.1, 0.3, 1.0, and 3.0 mg/m³ CeO2 were applied. BaSO4 was used as representative for a non-toxic nanomaterial and was applied in one high concentration of 50.0 mg/m³. Rats were exposed for 1, 28 and 90 days. Also post-exposure investigations were performed after 28 and 90 days. Respective investigations should provide data for better risk assessment of nanoparticles and better differentiation between materials.

Lung burden analytics, hematology, histopathology and BAL fluid analysis were included as guideline required endpoints. Broad gene expression analysis and immunohistochemistry were performed as additional sensitive endpoints. The latter should help identify early biomarkers for potential long-term effects and get better insights in the mechanisms of action of poorly soluble nanomaterial after inhalation. Gene expression analysis was done in AEII cells to determine their contribution on cellular responses to nanoparticles.

Exposure to 3.0 mg/m³ CeO2 revealed impaired particle clearance and overload. This was accompanied by inflammation, verified by histopathology, BAL fluid analysis, and gene expression. Gene expression analysis further showed upregulation of oxidative stress and fibrosis related enzymes (Lpo and Mmp12) in AEII cells. Immunohistochemical examinations indicated increased cell proliferation and DNA damage. Post-exposure examinations displayed persistence of effects, especially inflammation. 1.0 mg/m³ CeO2 exposure caused similar effects as the high dose group but less severe, with clearance half-times at the overload threshold. 0.3 mg/m³ CeO2 exposure induced slight upregulation of inflammatory mediators, including Il-1α and Il-1ß, at absent overload. 0.1 mg/m³ CeO2 nanoparticle exposure did not cause any effects.

The translocation of CeO2 to the liver and kidney was low. Although a significant increase was measured in liver tissue, the overall amount of particulate cerium was less than 1%. Gene regulation was restricted to slight overexpression of inflammatory mediators. In kidney tissue no significant amount of particulate cerium was measured.

BaSO4 exposure caused slight histopathological findings, mainly in the nasal compartment. It was cleared rapidly from the respiratory tract. Although levels of Lpo and Mmp12 were increased, the overall contribution of AEII cells defense against BaSO4 nanoparticles was low.

The results were all in all very consistent with clear time and concentration dependency. At high CeO2 concentrations the inflammation is related to overload. Effects at low dose levels suggest particle-specific reactivity e.g. due to CeO2 catalytic activity. AEII cells clearly contribute to the defense against inhaled nanomaterial. Histopathological findings and Mmp12 upregulation suggest a substantial risk of long-term fibrosis development. Based on the results a NOAEL of 0.41 mg/m³ could be determined for CeO2 nanoparticle exposure.

keywords

Nanopartikel, Inhalation, Genexpression ; Nanoparticles, Inhalation, Gene expression

kb

7.489