Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Jana Schwieger

Untersuchung der Überlebensrate und Neuritenaussprossung frisch isolierter auditorischer Neurone bei Einsatz einer Kombination von Wachstumsfaktoren und eines Mitosehemmers

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109471

title (engl.)

Investigation of survival rate and neurite outgrowth of freshly isolated auditory neurons under addition of a growth factor combination and a mitotic inhibitor

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/schwiegerj_ws16.pdf

abstract (deutsch)

Vielen Menschen mit Hörbeeinträchtigungen kann heutzutage durch die Insertion eines Cochlea-Implantates (CI) geholfen werden. Da das Hörempfinden mit dem CI dem des ursprünglichen Gehörs aufgrund verschiedener Faktoren wie verminderter Selektivität durch eine eingeschränkte Nerv-Elektroden-Interaktion nachsteht, besteht hier weiterer Verbesserungsbedarf. Durch eine Überlebenssteigerung der durch das CI zu stimulierenden auditorischen Neurone und eine Regeneration ihrer Neuriten zum Implantat hin erhofft man sich, dies zu erreichen. Für applizierte Wachstumsfaktoren konnten solche Effekte zum Teil nachgewiesen werden.

Das Ziel der hier vorgestellten Studien war es in vitro weitere Grundlagenerkenntnisse für die CI-Verbesserung durch den Einsatz neurotropher Faktoren (NTFs) zu gewinnen. So wurde die Wirkung von hochkonzentriertem „brain-derived neurotrophic factor“ (BDNF) und „ciliary neurotrophic factor“ (CNTF) alleine und in Kombination auf kultivierte Spiralganglienneurone (SGN) untersucht. Zusätzlich wurde ein neues Kulturvierungsverfahren mit einer reduzierten Gliazellproliferation und der Möglichkeit zur Langzeitbeobachtung neonataler SGN für die auditorische In-vitro-Forschung etabliert.

In der ersten Versuchsreihe wurden hohe Konzentrationen von BDNF und CNTF alleine oder in Kombination für 48 Stunden dem Medium der Spiralganglienzell (SGC)-Kultur zugegeben. In allen Zellen der Kultur konnte durch immunzytochemische Färbung (ICC) der BDNF-spezifische „tryosine receptor kinase B“ (trkB)-Rezeptor nachgewiesen werden. Hingegen beschränkte sich die Expression des CNTF-spezifischen CNTF-Rezeptor α (CNTFRα) vorwiegend auf Neurone. Durch den jeweiligen Faktor wurden sowohl das Überleben, als auch die Neuritenaussprossung der SGN signifikant verbessert. Einzeln eingesetzt zeigte sich für BDNF eine effektivere neuronale Überlebensratensteigerung als bei CNTF-Behandlung. CNTF dagegen induzierte ein signifikant längeres Neuritenwachstum als BDNF. Wurden beide Faktoren kombiniert, so ergänzten sie sich in ihrer Effektivität für Überlebensratensteigerung und Neuritenaussprossung. Bei der Analyse der Morphologie zeigte sich, dass durch die Kombination der beiden NTFs eine signifikante Zunahme der bipolaren Neurone und Reduktion der Neurone ohne Neuriten erreicht werden kann. Im Gegensatz zu bisherigen, für niedrigkonzentriertes BDNF und CNTF, durchgeführten Studien, konnten wir mit den hier applizierten Konzentrationen längeres Neuritenwachstum und gesteigertes SGN-Überleben erzielen. Zusätzlich konnten wir nachweisen, dass diese NTFs alleine schon einen starken Effekt auf die Ausprägung der Morphologie in vitro haben. Und vor dem Hintergrund verbesserter Implantatleistung durch Neuritenregeneration liefern diese neuen In-vitro-Erkenntnisse mögliche Erklärungen für die gesteigerte Hörleistung der Tiere bei bisher durchgeführten In-vivo-Studien mit kombiniertem BDNF und CNTF. Die Kombination dieser beiden NTFs zeigt ein großes Potential für den Einsatz in einem bioaktiven CI.

In Rahmen der zweiten hier vorgestellten Studie wurde die Aufreinigung der SGC-Mischkultur durch den Einsatz des DNA-Synthese-spezifischen Mitoseinhibitors Cytarabin (AraC) untersucht. Bei Analysen kultivierter SGN wird häufig diskutiert, dass die Ergebnisse durch die z.T. massive Vermehrung der nicht-neuronalen Zellen, zumeist Gliazellen, beeinflusst werden. In den hier beschriebenen Versuchen wurde AraC als Mitosehemmer eingesetzt, um die in Kultur proliferierten Zellen zu entfernen. Inhibierte und nicht inhibierte Kulturen mit Zugabe von Serum, BDNF oder BDNF in Kombination mit Neurotrophin-3 (NT3) wurden für vier respektive sieben Tage kultiviert. Durch die zelltypspezifischen ICC-Färbungen konnte gezeigt werden, dass der größte Anteil der nicht-neuronalen Zellen aus S100-positiven Gliazellen (Schwannzellen und Satellitenzellen) besteht und ein geringerer auf die Vimentin-positiven Fibroblasten entfällt. Diese Zellen konnten durch die Zugabe von AraC zum Kulturmedium effektiv an ihrer Vermehrung gehindert werden, nachgewiesen durch die Reduktion der Gesamtzellzahl. Dadurch wurde der prozentuale Anteil der SGN in der Kultur signifikant erhöht und das Verhältnis von nicht-neuronalen Zellen pro SGN in Richtung Neurone verschoben. Die verbliebenen Gliazellen waren in der mitoseinhibierten Kultur vorwiegend Neuronen-assoziiert. Auch wurde nachgewiesen, dass weder das Überleben, noch die Neuritenlänge oder der Somadurchmesser der SGN signifikant durch AraC oder die reduzierten Gliazellen beeinflusst waren. Außerdem konnte durch die AraC-Applikation zu der serumhaltigen Kultur eine Ablösung der Zellen durch übermäßige Proliferation effektiv verhindert werden. Bei stark verminderter Anzahl der nicht-neuronalen Zellen und Zugabe von BDNF und NT3 fiel in der Kultur eine Veränderung im Verlauf der Neuriten auf. Diese waren verzweigter, verliefen vermehrt gebündelt und waren möglicherweise miteinander verbunden.

Der Einsatz von AraC in der SGC-Kultur ist ein effektives Mittel, um eine unkontrollierte Proliferation der nicht-neuronalen Zellen zu verhindern und gleichzeitig den Anteil der SGN zu erhöhen, ohne diese negativ zu beeinflussen. Die Möglichkeit zur Interaktion der Neurone mit ihren Schwannzellen bleibt erhalten, wobei die Neuriten jedoch zum Teil frei von umgebenden Zellen verlaufen. Die Mitoseinhibition ermöglicht eine Langzeitkultivierung der neonatalen SGC und die Untersuchung der Interaktion zwischen Gliazellen und Neuronen.

Die hier präsentierten Methoden sind dafür prädestiniert, in weiteren Studien miteinander kombiniert zu werden, da sie sich möglicherweise vorteilhaft ergänzen.

abstract (englisch)

Many people suffering from hearing loss can benefit from the insertion of a cochlear implant (CI). The hearing perception with a CI is still not comparable with the physiological hearing due to, amongst others, a low selectivity caused by the limited nerve-electrode-interface. Therefore, further improvements are needed to optimize the interaction between the nerve and the electrode. This could be achieved by an increased survival of the spiral ganglion neurons (SGN) and a regeneration of the nerve fibers towards the electrode array. Growth factor application shows a huge potential for treatment strategies with increased neuronal survival and neurite outgrowth.

Aim of the two studies presented here was to gain further basic findings for CI-improvements by neurotrophic factor (NTF)-treatment in vitro. The effect of high concentrations of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and ciliary neurotrophic factor (CNTF), alone and in combination, was analyzed on dissociated SGN. Additionally, a new in-vitro-cultivation method for auditory research with a reduced glial cell proliferation and suitable for long term incubation of neonatal SGN was established.

In the first study, SGN were cultivated for 48 hours with high concentrations of BDNF or CNTF, alone or in combination. By immunocytochemistry (ICC) the BDNF-specific tryosine receptor kinase B (trkB)-receptor was detected at all spiral ganglion cells (SGC) whereas the CNTF-specific CNTF receptor α (CNTFRα) was expressed neuron-associated. Both factors significantly increased the neuronal survival and the neurite outgrowth. BDNF was significantly more potent to increase the survival and CNTF induced a significantly longer neurite length. In combination, both NTFs were complementary in their beneficial effects, leading to an additive increase in the neuronal survival rate and an additional increase in neurite length. The combination of both factors significantly increased the number of bipolar neurons and reduced the number of neurons without neurites. Compared to previous studies using low concentrations of BDNF and CNTF, we induced a longer neurite outgrowth and an increased neuronal survival by addition of high concentrations of the NTFs. Additionally, we demonstrate that already these two combined factors have this great impact on the SGN morphology in vitro. These results also provide possible explanations for the improved threshold sensitivity detected in previous in-vivo studies with combined BDNF and CNTF due to neurite regeneration for CI-improvement. The combination of these two NTFs bears a huge potential for application in a bioactive CI.

In the second study presented here the purification of the SGC-mix culture by addition of the selective DNA synthesis mitotic inhibitor cytarabine (AraC) was analyzed. When investigating cultured SGN it is often discussed that the results are influenced by the partly massive proliferation of non-neuronal cells, mainly glial cells. In the experiments performed here, AraC was added as mitotic inhibitor to the culture to erase the proliferating cells. Inhibited and uninhibited cultures supplemented with serum, BDNF or BDNF and neurotrophin-3 (NT3) were incubated for four and seven days. The cell-specific ICC revealed that the main ratio of non-neuronal cells was S100-positive glial cells (SGSC and satellite cells) and a smaller amount vimentin-positive fibroblasts. Both, glial cells and fibroblasts were effectively hindered to proliferate in culture by addition of AraC, proven by the decreased number of total cells. Thereby the percentage of neurons in culture was significantly increased and the proportion between non-neuronal cells and neurons was shifted towards SGN. The remaining glial cells in the mitotic-inhibited culture were mainly neuron associated. Neither the survival nor the neurite length or the soma diameter of the SGN were significantly affected directly by AraC-treatment or indirectly by the reduced glial cell proportion. Additionally the treatment of serum-containing cultures with AraC protected against the detachment of cells due to excessive cell proliferation. When the number of non-neuronal cells was considerably reduced and BDNF and NT3 were added, neurites showed an increased branching, fasciculation and probably connections to neighboring neurites.

The addition of AraC to the SGC culture is an effective tool to control the proliferation of non-neuronal cells and to increase the ratio of neurons, without negatively influencing the neurons. Neurons can still interact with their Schwann cells while the neurites extent partly free of surrounding cells. Mitotic inhibition is suitable for long-term cultivation of neonatal SGC and may provide new insights in the interaction of glial cells and neurons.

The methods presented here of BDNF, CNTF and AraC-treatment are predestined to be combined in future studies since they may complement each other.

keywords

Spiralganglienneurone, neurotrophe Faktoren, neuronale Aufreinigung; spiralganglion neurons, neurotrophic factors, neuronal purification

kb

225