Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Isolde Ursula Elisabeth Schuster

Novel serological assays for

determination of the distribution and of

hosts of Crimean-Congo hemorrhagic

fever virus

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110942

title (ger.)

Neue serologische Tests zur Ermittlung der Verbreitung und zur Identifizierung von Wirten des Krim-Kongo-Hämorrhagischen-Fieber-Virus

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/schusteri_ws17.pdf

abstract (deutsch)

Das Krim-Kongo-Hämorrhagische-Fieber-Virus (CCHFV) ist ein Zecken-übertragenes Virus, das in vielen Ländern Afrikas, Asiens und Europas endemisch ist. Seine Vektoren und Reservoire sind Schildzecken, die das Virus während der Blutmahlzeit auf ihre Blutwirte übertragen und umgekehrt. CCHFV löst in Tieren keine Erkrankung aus, diese können aber eine Virämie entwickeln und serokonvertieren.

 

Durch Zeckenstiche, das Zerdrücken infizierter Zecken oder durch den Kontakt zu Blut, Körperflüssigkeiten oder Geweben virämischer Tiere und Menschen kann das Virus auf Menschen übertragen werden und in ihnen eine schwere Erkrankung, das Krim-Kongo-Hämorrhagische-Fieber (Crimean-Congo hemorrhagic Fever, CCHF) auslösen, das mit einer Sterblichkeitsrate von bis zu 80% einhergeht. Bisher ist weder eine Impfung noch eine spezifische Therapie verfügbar.

 

In den letzten fünfzehn Jahren sind CCHF Fälle in vier bis dato als CCHF-frei geltenden europäischen Ländern erstmals aufgetreten, unter ihnen Spanien als erstes betroffenes westeuropäisches Land 2016. Trotz der Angst einer weiteren Ausbreitung in Europa und trotz der Dringlichkeit der Vorbeugung humaner Infektionen ist wenig über die Verbreitung von CCHFV außerhalb der Länder, aus denen bereits CCHF-Fälle berichtet wurden, bekannt. Hierzu können Seroprävalenzstudien in Tieren wesentliche Hinweise liefern, jedoch sind keine kommerziellen serologischen Tests zur Diagnostik von CCHFV in Tieren verfügbar und die bisher publizierten laborspezifischen Tests wurden nicht validiert.

 

Deshalb war das Ziel der hier vorgelegten Arbeit, Enzym-linked Immunosorbent Assays (ELISA) Tests zur Detektion CCHFV-spezifischer IgG Antikörper in Tieren zu entwickeln und zu validieren.

 

Zunächst wurden Spezies-spezifische Tests zur Detektion CCHFV-spezifischer Antikörper in Schafen und Ziegen auf Basis eines Protokolls zur Untersuchung von Rindern durch Modifikation verschiedener Parameter hergestellt. Dabei ist der neue CCHFV in-house-ELISA zur Untersuchung von Ziegenseren der erste speziell für diese Spezies hergestellte CCHFV-ELISA. Als Referenztestes wurden kommerziell erhältliche, für die Untersuchung humaner Seren hergestellte ELISAs und Immunfluoreszenztests für die Untersuchung von Schafen und Ziegen adaptiert. Alle Tests wurden durch vergleichende Analyse gegeneinander validiert, wobei diagnostische Sensitivitäten und Spezifitäten von 94 bis 100% ermittelt werden konnten. Außerdem wurden diese sowie Rinder-spezifische Tests in zwei Seroprävalenzstudien in Albanien und der Ehemaligen Jugoslawischen Republik Mazedonien beziehungsweise Bulgarien und der Türkei durchgeführt, wobei eine hohe Seroprävalenz in den aus diesen Ländern untersuchten Rindern, Schafen und Ziegen gefunden wurde. Die Ergebnisse weisen auf eine starke Zirkulation des Virus in der Ehemaligen Jugoslawischen Republik Mazedonien hin, was überraschend ist, da von dort bisher nur wenige CCHF-Fälle berichtet wurden. Außerdem belegen sie eine Verbreitung des Virus über ganz Albanien und verifizieren den Süden Bulgariens und die Nord- und Zentraltürkei als Hauptendemiegebiete in diesen beiden Ländern.

 

Um zu ermitteln, welche Tierart der geeignetste Indikator für die Verbreitung von CCHFV ist, wurde die Seroprävalenz der drei getesteten Tierarten aus Albanien und der Ehemaligen Jugoslawischen Republik Mazedonien miteinander verglichen. Hierbei wurde ermittelt, dass Schafe und Ziegen geeignetere Indikatoren sind als Rinder und deshalb bevorzugt zur Ermittlung der Verbreitung von CCHFV herangezogen werden sollten.

 

Neben den Spezies-spezifischen Tests wurde der erste auf rekombinantem Antigen basierende kompetitive ELISA (cELISA) für CCHFV und der zweite überhaupt beschriebene CCHFV cELISA entwickelt und unter Verwendung von 833 Seren von zwölf verschiedenen Tierarten und Menschen validiert, wobei eine diagnostische Sensitivität von 95% und eine diagnostische Spezifität von 99% ermittelt wurden. Zuvor waren 33 CCHFV-spezifische monoklonale Antikörper (mAk) in verschiedenen Tests charakterisiert worden, um den für die Entwicklung des Tests geeignetsten mAk zu identifizieren.

 

Mittels des neuen cELISA können Seroprävalenzstudien in verschiedenen Tierarten durchgeführt werden, auch um die Rolle verschiedener Tierarten im Infektionsgeschehen des Virus zu verstehen. Außerdem können mittels des Tests Tierarten, die essentiell zur Aufrechterhaltung der Viruszirkulation in der Natur sind, identifiziert und dann gegen CCHFV und/oder Zeckenbefall geimpft werden. Der monoklonale Antikörper, der im cELISA verwendet wird, sowie sein Epitop, könnten darüber hinaus vielversprechend für die Entwicklung diagnostischer Tests, Therapeutika und Impfungen sein.

 

Die neuen Tests zur Detektion CCHFV-spezifischer Antikörper haben sich als verlässlich und einfach durchführbar erwiesen und sollten kommerzialisiert und CCHF-betroffenen und gefährdeten Ländern zur Identifikation von Risikogebieten und Erstellung von CCHFV-Verbreitungskarten zur Verfügung gestellt werden.

abstract (englisch)

Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (CCHFV) is a tick-borne virus that is endemic in many countries of Africa, Asia and Europe. The vector and reservoir of CCHFV in nature are ixodid ticks, that can transmit the virus during their blood meal to their blood hosts and vice versa. CCHFV infected animals do not show clinical signs but can develop a viremia and seroconvert subsequently.

 

Via tick-bite, the crushing of infected ticks and contact to blood, bodily fluids and tissue of viremic animals or humans, the virus can be transmitted to humans, in which it can cause the Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHF) with case-fatality rates of up to 80%. No vaccination or treatment is currently available.

 

Four previously unaffected European countries reported CCHF cases within the last fifteen years, among them Spain as first affected Western European country in 2016. Despite the thread of a further spread of the virus within Europe and the impact of prevention measures against human infections, little is known regarding the CCHFV situation in countries other than those with known CCHF cases. Seroepidemiological studies in animals could provide more insight, but there are no commercial tests for CCHFV serology in animals available and most of the published in-house tests have not been validated. Therefore, the aim of the here presented work was the development and validation of Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the detection of CCHFV-specific IgG antibodies in animals.

 

At first, species-specific in-house ELISAs for the detection of CCHFV-specific antibodies in sheep and goats where developed on the basis of a protocol for testing sera from cattle by modification of several parameters. Hence, the in-house ELISA for testing of goats is the first CCHFV ELISA specifically designed for this species. As reference tests, immunofluorescence and ELISA tests commercially available for CCHFV serology in humans were adapted to be used in sheep and goats. All tests where validated in comparison to each other, revealing diagnostic sensitivities and specificities of 94-100%. Further, the new tests as well as cattle-specific tests were applied implementing a specifically designed diagnostic scheme in two seroepidemiological studies in Albania and the Former Yugoslav Republic of Macedonia as well as Bulgaria and Turkey, finding high seroprevalence in cattle, sheep and goats. The results indicated a high level of circulation of CCHFV in the Former Yugoslav Republic of Macedonia, which was rather surprising, as only few CCHF cases have been reported from this country so far. They also confirmed a spread of CCHFV throughout the whole of Albania, and verified the south of Bulgaria and northern and central Turkey as the main endemic areas of those countries.

 

To assess the species most suited as indicator of the distribution of CCHFV, the prevalence found in the animals from Albania and the Former Yugoslav Republic of Macedonia were compared, revealing sheep and goats as more suitable indicator animals than cattle, which should therefore be used preferably for the determination of the local CCHFV distribution.

 

Next to the species-specific tests, the first competitive ELISA (cELISA) for CCHFV based on recombinant antigen and the second CCHFV cELISA described so far has been developed within this work. In order to find a suitable monoclonal antibody (mAb) for the development of the test, 33 CCHFV-specific mAbs have prior been characterized in different tests.

 

The cELISA was validated using 833 sera from twelve different animal species and humans, revealing a diagnostic sensitivity of 95% and a diagnostic specificity of 99%.

 

Utilizing the new cELISA, seroprevalence studies in different animal species will be possible which in turn may help to understand their role in the ecology of CCHFV. Moreover, species essential for the circulation of CCHFV could therewith be identified and vaccinated against CCHFV and/or tick infestation in order to control the CCHFV circulation in the wild. The monoclonal antibody used in the new cELISA as well as its epitope may further be promising targets in the development of diagnostic tests, therapeutics and vaccines.

 

The new tests for the detection of CCHFV-specific antibodies developed within this work have been demonstrated to be valid and reliable and should be commercialized and made available to CCHFV affected and endangered countries to identify high risk areas and to draw a comprehensive map of the CCHFV distribution in Europe and the world eventually.

keywords

Krim-Kongo-Hämorrhagisches-Fieber-Virus, ELISA, Seroepidemiologische Studien; Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Enzyme-linked Immunosorbent Assay, Seroepidemiological Studies

kb

409