Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Saskia Schütze

DNA stability of stallion sperm: Factors affecting chromatin integrity in individual stallions

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107642

title (ger.)

DNA-Stabilität von Hengstspermien: Einflussfaktoren auf die Chromatinintegrität individueller Hengste

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/schuetzes_ws15.pdf

abstract (deutsch)

Bei Hengsten zeigen sich große individuelle Unterschiede in ihren Befruchtungsraten. Da die Integrität der DNA wesentlich für eine erfolgreiche Befruchtung und Entwicklung des Embryos ist, kann die DNA-Struktur als Parameter für das Befruchtungspotenzial genutzt werden oder mögliche Subfertilität erklären. Zudem bieten Informationen über die die Chromatinintegrität beeinflussenden Faktoren sowie die unterschiedliche Anfälligkeit der Spermien für DNA-Schädigung neue Ansätze zur Aufklärung verminderter Befruchtungsraten. Die Chromatinpackung, die durch Interaktionen zwischen der DNA und spermienspezifischen Protaminen sowie durch Disulfidbrücken zwischen den Protaminen vermittelt wird, ist hierbei vermutlich ein wesentlicher Faktor.

Im ersten Teil der Studie war das Ziel herauszufinden, ob Spermien von Hengsten, die hinsichtlich ihrer Befruchtungsfähigkeit eingestuft wurden, Unterschiede in der Chromatinintegrität bzw. –stabilität gegenüber induzierter Schädigung aufweisen.

Die Spermien-DNA wurde einerseits durch Säuredenaturierung mit verschiedenen Einwirkzeiten und andererseits durch Inkubation mit Fenton´s Reagent, zur Provokation von oxidativem Stress, geschädigt. Anschließend wurde die DNA-Integrität mit Hilfe des Spermien-Chromatin-Struktur-Assay (SCSA) ermittelt. Dieser beruht auf einer Proteindenaturierung mittels Säure sowie einer anschließenden durchflusszytometrischen Analyse nach Anfärben mit Acridine Orange und ermöglicht eine Unterscheidung zwischen intakter und geschädigter DNA. Es wurde nachgewiesen, dass Hengste mit schlechten Befruchtungsraten einen höheren Anteil an morphologisch abweichenden Spermien, weniger vorwärts bewegliche Spermien und einen erhöhten Anteil an Spermien mit geschädigter DNA im Vergleich zu Hengsten mit guten Befruchtungsraten aufweisen. Weiterhin wurde festgestellt, dass sich die Empfindlichkeit für säureinduzierte sowie durch oxidativen Stress verursachte DNA-Schädigung mit abnehmenden Befruchtungsraten erhöht. Nach einer Säureeinwirkzeit von 5 min erreichte das Ausmaß der DNA-Fragmentation ein Plateau, bei welchem die größten Unterschiede zwischen den Individuen nachweisbar waren. Eine Dosis-abhängige Zunahme der DNA-Schädigung wurde mit zunehmenden Konzentrationen an Fenton`s Reagent deutlich, wobei individuell verschiedene Schwellenwerte für das Induzieren von Schädigung bestanden. Letztendlich konnte jedoch bei allen Hengsten 100% DNA-Schädigung durch oxidativen Stress induziert werden. Zusätzlich zu den SCSA Messungen wurden Fourier-Transform-Infrarot Spektra (FTIR) von Fenton-behandelten Spermaproben angefertigt, bei denen nach oxidativer Schädigung deutliche Unterschiede in den Molekülbewegungen der DNA-charakteristischen Phosphatgruppen erkennbar waren.

Ziel des zweiten Teils der Studie war herauszufinden, ob die DNA-Stabilität gegenüber induzierter Schädigung abhängig vom Grad der Chromatinpackung ist. Dafür wurden unreife Spermien aus dem Nebenhoden (Nebenhodenkopf, -körper, -schwanz) isoliert und analysiert sowie Spermien untersucht, die mit chemischen Verbindungen behandelt wurden, welche Disulfidbrücken im Chromatin reduzieren bzw. oxidieren (Dithiothreitol bzw. Diamide). Es wurde ermittelt, dass sich die Granularität der Spermien mit zunehmender Reife erhöht, welche die verminderte Zugänglichkeit für den DNA-bindenden Farbstoff Acridine Orange und die verminderte Empfindlichkeit für induzierbare Schädigung durch Säuredenaturierung erklärt. Eine Behandlung mit Dithiothreitol (DTT) resultierte in verminderter Granularität der Spermien, was eine erhöhte Zugänglichkeit für Acridine Orange und die zunehmende Anzahl an Spermien mit geschädigter DNA, im Gegensatz zu unbehandelten Spermien oder zu solchen, die mit Diamiden behandelt worden sind, bestätigt. Außerdem konnten die Ergebnisse mit elektronenmikroskopischen Bildern belegt werden, auf denen eine aufgelockerte Chromatinstruktur nach Reduktion der Disulfidbrücken sichtbar war. Alles in allem lässt sich schlussfolgern, dass die Packung der DNA die Empfindlichkeit des Chromatins gegenüber induzierter Schädigung beeinflusst, wodurch wiederum Unterschiede in den Befruchtungsraten von Hengsten erklärt werden können.

abstract (englisch)

Stallions exhibit great inter-individual variation in fertility rates. DNA intactness is essential for successful fertilization of an oocyte and embryonic development, and therefore analysis of sperm DNA structure might be used to foresee fertilizing potential or explain subfertility. Moreover, insights in factors affecting chromatin intactness and susceptibility for DNA damage might give rise to approaches for counteracting decreased chromatin intactness and fertility rates. Chromatin packing, through interactions between DNA and sperm specific protamines via disulfide bonds has been suggested to be one of the factors affecting chromatin stability.

The aim of the first part of this study was to determine if sperm from stallions classified according to their fertility exhibit differences in chromatin intactness and stability towards induced DNA damage. Sperm DNA damage was induced via exposure to acid denaturation for different durations as well as exposure to different concentrations of Fenton’s reagent to provoke oxidative stress/damage. DNA intactness was analyzed using the sperm chromatin structure assay (SCSA), which involves acid denaturation and flow cytometric analysis of acridine orange stained sperm for discriminating between intact and damaged DNA. It was found that poor fertility stallions exhibited higher percentages of morphologically abnormal sperm, lower percentages of motile sperm, and a decreased DNA intactness with SCSA, as compared to good fertility stallions. Furthermore, the susceptibility for acid denaturation and oxidative stress induced sperm DNA damage was increased with decreasing fertility rates. DNA fragmentation reached a plateau with acid denaturation for 5 minutes, with largest differences amongst individuals. A dose-dependent increase in DNA damage was found with exposure to Fenton’s reaction and oxidative stress, with individual differences in the threshold for inducing damage, while ultimately resulting in DNA fragmentation indices of 100%. In addition to SCSA analysis, we collected Fourier transform infrared (FTIR) spectra of sperm samples treated with increasing concentrations of Fenton’s solution and determined that induced oxidative stress resulted in alterations in characteristic vibration bands arising from phosphate groups as present in the DNA-backbone.

The aim of the second part of this study was to determine if sperm DNA stability towards induced damage depends on the extent of chromatin packing (DNA-protein interactions). Therefore, immature spermatozoa isolated from the epididymis (caput, corpus and cauda regions) were analyzed, as well as sperm treated with chemical compounds for reducing and oxidizing disulfide bonds in chromatin (dithiothreitol and diamide, respectively). It was found that sperm granularity increased with maturation, which coincided with decreased accessibility for the DNA binding dye acridine orange and decreased susceptibility for induced DNA damage via acid denaturation. Treatment with dithiothreitol (DTT) resulted in sperm with reduced granularity coinciding with higher accessibility for acridine orange and increased numbers of sperm with acid denatured DNA, as compared to non-treated sperm or sperm treated with diamide. Inspection of the sperm ultrastructure using transmission electron microscopy, confirmed that the sperm nucleus displayed a less dense ultrastructure after reduction of disulfide bonds, whereas treatment with Fenton’s reagent resulted in severe damage of the nuclear membrane. Taken together, we conclude that DNA packing affects susceptibility of chromatin for inducing DNA damage, which in turn might explain differences in fertility rates amongst stallions.

keywords

Fertilität, Chromatinintegrität, Protamin; fertility, chromatin integrity, protamine

kb

1.951