Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Katharina Helene Christine Schürmann

 

 Entwicklung eines phosphatfreien Verdünners zur Verbesserung der Qualität von Hengstsamen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106894

title (engl.)

Development of a phosphate free semen extender to improve stallion sperm quality

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/schuermannk_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Aufbereitungsprotokoll für Hengstsamen so anzupassen, dass die Spermien mit dem Fluoreszenzfarbstoff Vibrant® DyeCycle™Violet Stain angefärbt werden können, der als Ersatz für den Farbstoff Hoechst33342 dienen soll. In einem Vorversuch zeigte sich, dass ein neuer phosphatfreier Verdünner zu entwickeln ist, um eine ausreichende Spermaqualität zu erhalten.

In den Hauptversuchen wurden gezeigt, dass es möglich ist, Hengstsamen in dem neu entwickelten Verdünner „Ka-Mops“ aufzubereiten und vergleichbare Ergebnisse wie bei der Nutzung des etablierten Verdünners KMT zu erzielen. Dafür wurden die frischen Ejakulate aufgeteilt und mit KMT und Ka-Mops verdünnt. Für die Auswertung wurde ein Thermotoleranztest bei 38°C durchgeführt. Bei 0,3 und 6 Stunden wurden Motilität und morphologische Integrität beurteilt sowie der akrosomale Status gemessen. Bei Hengst I waren nach 0, 3 und 6 Stunden bei KMT 78,7, 73,3 und 69,5% der Spermien und bei Ka-Mops 81,4, 78,8 und 73,3% morphologisch unverändert. Bei Hengst II waren bei KMT 77,4, 72,3 und 69,0 % im Vergleich zu Ka-Mops 80,6, 75,9 und 70,1% der Spermien morphologisch unverändert. Beim Vergleich der Motilität zeigten sich bei Hengst I nach 0, 3 und 6 Stunden bei KMT folgende Ergebnisse: 78,7, 73,3 und 69,6% der Spermien als motil bei Ka-Mops 81,4, 78,8 und 73,3%. Bei Hengst II zeigten sich bei KMT 77,4, 72,3 und 69,0 %, bei Ka-Mops 80,6, 75,9 und 70,1% als motil. Bei der flowzytometrischen Analyse zeigten sich bei Hengst I bei KMT 58,9, 59,5 und 58,0% der Spermien FITC/PNA PI negativ und bei Ka-Mops 54,2, 58,3 und 65,6%. Bei Hengst II lagen die Werte bei 60,7, 73,9 und 69,2% und 51,0, 54,0 und 54,2%.

Im Vergleich zwischen dem neu entwickelten Tiefgefrierverdünner TG-Mops und dem am Niedersächsischen Landgestüt genutzten TG-Celle (INRA82 + 2,5% Eigelb und 2,5% Glycerol) wurden die Ejakulate zunächst in gleicher Weise wie für den Frischsamenversuch aufbereitet. Anschließend wurden zu den Proben der Tiefgefrierverdünner zugefügt. In den Konzentrationen 100 und 50x106 Spermien pro ml wurden die Proben nun in 0,25ml Pailletten kryokonserviert. Nach dem Auftauen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Spermienqualität zwischen den unterschiedlich aufbereiteten Proben.

Hierzu zeigten sich bei der Morphologie folgende Werte: Hengst I Konzentration 100x106 Spermien/ml Verdünnerkombination K/C 72,6, 71,7 und 70,7%, K/M 79,7, 75,1 und 70,8%, M/C 74,4, 75,6 und 78,7% und M/M 78,2, 76,6 und 73,3% morphologisch intakte Spermien. Bei der Konzentration 50x106 Spermien/ml lagen die Werte bei der Verdünnerkombination K/C bei 77,7, 71,0 und 74,3%, K/M 77,0, 75,0 und 74,4%, M/C 79,9, 77,2 und 74,4% und M/M 79,8, 77,2 und 67,5% morphologisch intakte Spermien.

Bei Hengst II zeigten sich bei der Konzentration 100x106 Spermien/ml folgende Werte: Verdünnerkombination K/C 73,8, 74,2 und 67,2%, K/M 76,7, 76,8% und 70,7%, M/C 71,8, 70,3 und 72,1% und M/M 75,3, 75,3 und 73,8% morphologisch intakte Spermien. Bei der Konzentration 50x106 Spermien/ml lagen folgende Ergebnisse vor: Verdünnerkombination K/C 77,7, 77,6 und 74,2%, K/M 77,6, 74,7 und 73,1%, M/C 76,0, 79,2 und 73,1% und M/M 72,4, 72,3 und 66,7% morphologisch intakte Spermien.

Die Motilitätsanalyse ergab bei Hengst I und II für die Konzentration 100x106 Spermien/ml folgende Ergebnisse: Verdünnerkombination K/C 78,0, 46,6, 15,5 und 2,3%, K/M 78,0, 46,1, 21,6 und 4,5%, M/C 81,4, 45,4, 14,1 und 1,4% und M/M 81,4, 43,0 18,9 und 3,2%. Bei der Konzentration 50x106 Spermien/ml zeigten sich folgende Ergebnisse: Verdünnerkombination K/C 78,0, 38,9, 18,3 und 3,1%, K/M 78,0, 33,2, 15,2 und 3,0%, M/C 81,4, 43, 17,9 und 2,9% und M/M 81,4, 38,2, 15,3, 3,3% motile Spermien.

Bei den Untersuchungen zum akrosomalen Status und der Plasmamembranintegrität zeigten sich für Hengst I für die Konzentration 100x106 Spermien/ml nachfolgende Werte: Verdünnerkombination K/C 23,4, 20,2 und 19,6%, K/M 20,3, 14,2 und 12,2, M/C 20,1, 13,9 und 14,0, M/M 17,1, 12,5 und 13,9 SYBR 14/PI negative Spermien. Bei der Konzentration 50x106 Spermien/ml lagen die Messergebnisse bei: Verdünnerkombination K/C 20,9, 30,0 und 19,5%, K/M 20,8, 15,4 und 13,9%, M/C 23,5, 16,5 und 15,7% und M/M 15,7, 14,1 und 12,3% SYBR 14/PI negative Spermien. Bei Hengst II zeigten sich bei der Konzentration 100x106 Spermien/ml diese Ergebnisse: Verdünnerkombination K/C 13,0, 5,2 und 2,3%, K/M 12,3, 7,8 und 3,9%, M/C 13,7, 10,1 und 5,0% und M/M 10,4, 4,3 und 3,3% SYBR 14/PI negative Spermien. Bei der Konzentration 50x106 Spermien/ml konnte man folgende Ergebnisse ablesen: Verdünnerkombination K/C 14,1, 7,9 und 4,5%, K/M 10,7, 7,4 und 4,7%, M/C 16,6, 6,5 und 5,5% und M/M 9,4, 8,9 und 4,4% SYBR 14/PI negative Spermien.

Die DFI-Werte lagen bei Hengst I bei nativ 9,3,Kontrolle 6,9, K/C 17,6, K/M 15,8, M/C 16,8 und M/M 17,5. Bei Hengst II bei native 15,8,9 Kontrolle 9,5, K/C 10,8, K/M 12,2, M/C 16,8 und M/M 19,3.

In der vorliegenden Arbeit wurden mit den neuen phosphatfreien Verdünnern Ergebnisse bei der Spermakonservierung erreicht, die den Vorgaben der WBFSH entsprechen. Hengstsamen kann somit in den neu entwickelten Verdünnern Ka-Mops und TG-Mops aufbereitet werden.

abstract (englisch)

The aim of the presented work was to adapt the preparation protocol for equine semen dilution to labeling with the fluorescence dye Vibrant® DyeCycle™Violet Stain, which is thought to replace Hoechst33342. In a first pretrial it became obvious that a new phosphate free extender is necessary to provide sufficient sperm quality.

The results indicate a qualitative similarity of the newly developed liquid semen extender Ka-Mops and KMT. Therefore, ejaculates were split, one part was diluted with KMT, the other with Ka-Mops. During the thermo-tolerance test at 38°C motility, morphology and acrosomal status of the sperm were evaluated after 0, 3 and after six hours as well.

The results for stallion I were after 0, 3 and 6 hours for KMT 78,7, 73,3 and 69,5% and for Ka-Mops 81,4, 78,8 and 73,3% of the sperm morphological unmodified. At stallion II there were for KMT 77,4, 72,3 and 69,0 % compared to Ka-Mops 80,6, 75,9 and 70,1% of the sperm morphological unmodified. Comparing the motility for Stallion I at 0, 3 and 6 hours for KMT there were following results: 78,7, 73,3 und 69,6% of the sperm motil for Ka-Mops 81,4, 78,8 and 73,3%. For Stallion II the results were KMT 77,4, 72,3 and 69,0 %, for Ka-Mops 80,6, 75,9 and 70,1% motil. In the flow cytometric analysis following results were found for Stallion I KMT 58,9, 59,5 und 58,0% of the sperm FITC/PNA PI negativ and for Ka-Mops 54,2, 58,3 and 65,6%. Stallion II the values for KMT were 60,7, 73,9 und 69,2% und 51,0, 54,0 und 54,2%.

For the comparison of the newly developed extender for cryoconservation TG-Mops with the extender used at the Niedersächsisches Landgestüt TG-Celle (INRA82 + 2,5% egg yolk und 5% glycerol) the ejaculates were prepared the same way as before. The extender was added to the samples. These were frozen in 0.25ml straws with sperm concentrations of 50x106sperm/ml and 100x106sperm/ml. No significant differences in motility, acrosomal status, membrane integrity, and DFI score were observed after thawing during the thermo-tolerance test.

For this purpose, the following values were found for the morphology: stallion I concentration 100x106 sperm/ml extender combination: K/C 72,6, 71,7 and 70,7%, K/M 79,7, 75,1 and 70,8%, M/C 74,4, 75,6 and 78,7% and M/M 78,2, 76,6 and 73,3% morphological intact sperm. Using the concentration of 50x106 spermatozoa/ml, the values of the extender combination were: K/C 77,7, 71,0 and 74,3%, K/M 77,0, 75,0 and 74,4%, M/C 79,9, 77,2 and 74,4% and M/M 79,8, 77,2 and 67,5% morphological intact sperm.

For stallion II the results for the concentration of 100x106 sperm/ml were as follows: extender combination K/C 73,8, 74,2 and 67,2%, K/M 76,7, 76,8% and 70,7%, M/C 71,8, 70,3 and 72,1% and M/M 75,3, 75,3 and 73,8% morphological intact sperm. When useing the concentration 50x106 sperm/ml the results were: extender combination K/C 77,7, 77,6 and 74,2%, K/M 77,6, 74,7 and 73,1%, M/C 76,0, 79,2 and 73,1% u and M/M 72,4, 72,3 and 66,7% morphological intact sperm.

The motility for stallion I and II for the concentration of 100x106 sperm/ml had following results: extender combination K/C 78,0, 46,6, 15,5 and 2,3%, K/M 78,0, 46,1, 21,6 and 4,5%, M/C 81,4, 45,4, 14,1 and 1,4% and M/M 81,4, 43,0 18,9 and 3,2%. For the concentration of 50x106 sperm/ml there were following results: extender combination K/C 78,0, 38,9, 18,3 and 3,1%, K/M 78,0, 33,2, 15,2 and 3,0%, M/C 81,4, 43, 17,9 and 2,9% and M/M 81,4, 38,2, 15,3, 3,3% motil sperm.

In the studies for the acrosomal status and the plasma membrane integrity for stallion I showed following results for the concentration of 100x106 sperm/ml: extender combination K/C 23,4, 20,2 and 19,6%, K/M 20,3, 14,2 and 12,2, M/C 20,1, 13,9 and 14,0, M/M 17,1, 12,5 and 13,9 SYBR 14/PI negative sperm. For the concentration of 50x106 sperm/ml the results were: extender combination K/C 20,9, 30,0 and 19,5%, K/M 20,8, 15,4 and 13,9%, M/C 23,5, 16,5 and 15,7% and M/M 15,7, 14,1 and 12,3±5,4% SYBR 14/PI negative spermatozoa. For stallion II for the concentration of 100x106 sperm/ml there were following values: extender combination K/C 13,0, 5,2 and 2,3%, K/M 12,3, 7,8 and 3,9%, M/C 13,7, 10,1 and 5,0% and M/M 10,4, 4,3 and 3,3% SYBR 14/PI negative spermatozoa. For the concentration of 50x106 sperm/ml this values can be seen: extender combination K/C 14,1, 7,9 and 4,5%, K/M 10,7, 7,4 and 4,7%, M/C 16,6, 6,5 and 5,5% and M/M 9,4, 8,9 and 4,4% SYBR 14/PI negative spermatozoa.

The DFI values for stallion I were nativ 9,3,control 6,9, K/C 17,6, K/M 15,8, M/C 16,8 and M/M 17,5. For stallion II 15,8 control 9,5, K/C 10,8, K/M 12,2, M/C 16,8 and M/M 19,3.

The results of the study indicate that sperm quality after dilution resp. dilution and freezing can be maintained with the new phosphate free extenders Ka-Mops and TG-Mops.

keywords

Hengstsamen, Verdünner, geschlechtsspezifisch sortierter Spermien, sexsorting, equine semen, extender

kb

1.195