Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Nicole Schneider

 

Glutamate transporters in retinal neurons

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103494

title (ger.)

Glutamattransporter in retinalen Neuronen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/schneidern_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Fünf verschiedene Glutamattransporter (Excitatory amino acid transpoters, EAATs) mit verschiedenen physiologischen Funktionen und diversen Expressionsmustern sind in Gliazellen und Neuronen des zentralen Nervensystems exprimiert. In der Netzhaut des Auges beeinflussen sie die visuelle synaptische Übertragung auf zwei unterschiedlichen Wegen. Zum einen entfernen sie Glutamat direkt aus dem synaptischen Spalt indem sie die Aufnahme des Neurotransmitters an den Transport von drei Natriumionen und einem Proton koppeln und im Gegenzug ein Kaliumion aus der Zelle heraustransportieren (Kanner and Bendahan, 1982; Zerangue and Kavanaugh, 1996; Levy et al., 1998). Zum anderen nutzen sie ihre kanalähnliche Anionenleitfähigkeit um das Membranpotential von Zellen zu modulieren und somit deren neuronale Erregbarkeit zu regulieren. Das erste Manuskript befasst sich mit der elektrophysiologischen Charakterisierung von zwei retinalen Glutamattransportern, GLT-1c und EAAT5, die gemeinsam in den Axonendigungen von Photorezeptoren exprimiert werden und zwei funktionell verschiedene Gruppen von EAATs repräsentieren (Rauen et al., 2004). Mit Hilfe der Patch-clamp Technik konnten wir zeigen, dass GLT-1c eine hohe Affinität für Glutamat besitzt und alle Voraussetzungen erfüllt um Glutamat aus dem synaptischen Spalt in die präsynaptischen Endigungen von Photorezeptoren zu transportieren und bestätigen, dass EAAT5 hauptsächlich als Anionenkanal fungiert. Wir fanden heraus, dass die besonders großen Anionenströme des EAAT5 in einer hohen Einzelkanalamplitude der Anionenkanälen dieses Transporters begründet liegen und das eine hohe Offenwahrscheinlichkeit der Kanäle bei negativen Spannungen ein effizientes Arbeiten des Transporters bei physiologischen Membranpotentialen, sowie die Regulation der Chloridkonzentration in retinalen Neuronen, ermöglicht. Eine Mutation des hoch affinen Glutamattransporters EAAT1 ähnelt durch eine reduzierte Glutamataufnahmekapazität, sowie erhöhte Anionenströme, die bei hyperpolarisierenden Potentialen langsam aktivieren (Jen et al., 2005; Winter et al., 2012), funktionell dem EAAT5. Diese Mutation basiert auf dem Austausch eines konservierten Prolins im Knick der Transmembrandomäne 5 gegen Arginin und ist assoziiert mit der episodischen Ataxie Typ 6 (EA 6), einer seltenen genetischen Erkrankung, die durch paroxysmale cerebrale Koordinationsstörungen charakterisiert ist. Wir verwendeten eine Kombination aus Patch-clamp Technik, Spannungsklemmfluorometrie (voltage clamp fluorometry, VCF) und kinetischen Simulationen an der homologen Mutation P259R des funktionell ähnlichen Glutamattransporters EAAT3, um die Änderungen im Transportzyklus des humanen EAAT1 durch die krankheitsverursachende Mutation P290R nachzuvollziehen. Unsere Experimente weisen darauf hin, dass eine veränderte Natriumassoziation an den Glutamat-freien Transporter die molekulare Grundlage für die Transporterfehlfunktion in EA6 darstellt. Glutamat ist ein bedeutender Neurotransmitter im zentralen Nervensystem und Fehlfunktionen von Glutamattransportern sind mit verschiedenen neurologischen und psychischen Krankheitsbildern verbunden. Die physiologische Funktion der verschiedenen Transportersubtypen ist noch nicht vollständig verstanden und es gibt nur begrenzte Informationen über kompensatorischen Mechanismen die einer Interaktion von verschiedenen EAAT Isoformen zugrunde liegen könnten. Inhibitoren die selektiv auf einzelne EAAT-Subtypen wirken sind daher sehr nützlich um die individuelle Rolle der EAATs in der synaptischen Übertragung und Neurotoxizität zu untersuchen. Im dritten Manuskript wurde die Funktionsweise von UCPH-101 und UCPH-102 auf die Glutamattransporter EAAT1, EAAT4 und EAAT5 untersucht. Vorherige Studien weisen darauf hin, dass diese Inhibitoren selektiv auf EAAT1 wirken und die Funktionsweise von EAAT2 und EAAT3 nicht beeinträchtigen. Wir konnten zusätzlich zeigen, dass UCPH-101 und UCPH-102 keinen Effekt auf EAAT4 und EAAT5 haben. Unter Anwendung verschiedenster experimenteller Methoden konnten wir demonstrieren, dass UCPH-101 nicht-kompetitiv auf die Funktion von EAAT1 wirkt und allosterisch an einer Stelle in der Trimerisierungsdomäne des Transporters bindet, ohne die Substrattranslokation in den benachbarten Monomeren zu beeinträchtigen.

 

abstract (englisch)

In mammals, five excitatory amino acid transporters with different physiological functions and diverse anatomical localization are expressed in glial and neuronal cells throughout the central nervous system. In the retina, EAATs shape the visual synaptic transmission in two distinct ways: they directly remove glutamate from the synaptic cleft by coupling the uptake of glutamate to the cotransport of three Na+ ions and one H+ and the countertransport of one K+ ion (Kanner and Bendahan, 1982; Zerangue and Kavanaugh, 1996; Levy et al., 1998) or use their thermodynamically uncoupled chloride conductance to regulate neuronal excitability by modulating the membrane potential of a cell. The first manuscript focuses on the electrophysiological characterization of two retinal glutamate transporters, GLT-1c and EAAT5, which are co-expressed in axon terminals of photoreceptors and assumed to represent the two functional distinct groups of EAATs (Rauen et al., 2004). While GLT-1c meets all requirements to facilitate high affinity glutamate uptake in presynaptic terminals of photoreceptors, our patch-clamp experiments support the notion that EAAT5 predominantly acts as anion channel. We discovered that a pronounced increase of the unitary current amplitude of EAAT5 anion channels is the functional basis of the particular large anion currents of this specialized transporter and that a high open probability of anion channels at negative potentials allows EAAT5 to efficiently work at physiological membrane potentials and to regulate the Cl- concentration of retinal neurons. A mutation of the high-capacity glutamate transporter EAAT1 is known to functionally resemble EAAT5 - with reduced glutamate uptake capacity and increased, slow activating anion currents at hyperpolarizing potentials (Jen et al., 2005; Winter et al., 2012). This mutant - containing an arginine instead of a conserved proline in the hinge of transmembrane domain 5 - is associated to episodic ataxia type 6, a rare human genetic disease characterized by paroxysmal cerebellar incoordination. We employed a combination of patch-clamp technique, voltage clamp fluorometry and kinetic simulations and used the homologous mutation P259R of the functional similar hEAAT3 to study changes in the hEAAT1 uptake cycle by the disease-associated mutation P290R. Our experiments suggest that altered sodium binding to the glutamate-free form of the mutant transporter is the molecular basis of transporter dysfunction in EA6. Glutamate is an important neurotransmitter in the CNS and dysfunctions of EAATs are correlated to several neurologic and psychiatric disorders. The distinct physiological functions of the various EAAT subtypes is not fully understood and only limited information about compensatory mechanisms resulting from interaction of different EAAT isoforms is available. Subtype-selective inhibitors are useful to investigate the individual role of EAATs in synaptic transmission and neurotoxicity. In the third manuscript we examined the mechanism of action of UCPH-101 and UCPH-102 on EAAT1, EAAT4 and EAAT5. In previous studies it was reported that these compounds display selectivity for EAAT1 over EAAT2 and EAAT3 and we could show that UCPH-101 and UCPH-102 are also ineffective at EAAT4 and EAAT5. Using different experimental approaches, we could demonstrate that UCPH-101 exhibits non-competitive inhibition of EAAT1 function and binds to an allosteric site in the trimerization domain of the transporter without affecting substrate translocation through the neighboring monomers in the trimer.

 

keywords

EAAT, Patch-Clamp Technik, Anionenkanal; EAAT, patch-clamp technique, anion channel

kb

6.081