Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Christiane Liliane Schnabel

Acute immune response of healthy horses to linear

DNA encoding Interleukin 12 and Interleukin 18

complexed with SAINT-18

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106840

title (engl.)

Acute immune response of healthy horses to linear DNA encoding Interleukin 12 and Interleukin 18 complexed with SAINT-18

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/schnabelc_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Wirkmechanismen in vivo applizierter mit SAINT-18 formulierter minimalistischer immunologisch definierter Genexpressions (MIDGE-Th1)-Vektoren (SAINT-18/DNA) zu charakterisieren. Dazu wurden zunächst potentielle Biomarker untersucht und mögliche Einflussfaktoren geprüft. Unter Berücksichtigung dieser wurden die Behandlungseffekte von SAINT-18/DNA auf systemischer und lokaler Ebene an gesunden Pferden identifiziert.

Fünfzehn monoklonale Antikörper gegen Zytokine verschiedener Spezies wurden auf Reaktivität mit equinen Zytokinen im Dot Blot, im Western Blot, in der Immunhistochemie und in der Durchflusszytometrie überprüft. Zehn der Antikörper waren (kreuz-) reaktiv mit vier verschiedenen equinen Zytokinen.

Aus diesen und weiteren verfügbaren validierten Nachweisverfahren für das Pferd wurde eine Kombination geeigneter Biomarker für immunologische Effekte der Behandlung mit SAINT-18 formulierten DNA-Vektoren ausgewählt. Diese wurden mit klinischen, hämatologischen, durchflusszytometrischen und histologischen Methoden kombiniert, um ein Gesamtbild der systemischen und lokalen Effekte der Behandlung zu zeichnen.

Zur Sicherung korrekter Vergleiche wurden interne Kontrollen jedes Individuums in die Studie eingeschlossen und Einflüsse der Eigenschaften der Pferde und der Methodik auf die Messungen der Biomarker untersucht. Als interne Kontrollen der systemischen Parameter dienten Baseline-Messungen vor der Behandlung der Pferde. Hohe interindividuelle Unterschiede in diesen Messungen sprechen für die Normalisierung von Behandlungseffekten auf individuelle Kontrollen.

Anhand der Baseline-Messungen vor Behandlung wurde festgestellt, dass das Alter der Pferde die Zusammensetzung der Blutleukozyten, ihre Morphologie und die Zytokinsekretion von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) gesunder Pferde beeinflusst. Ältere Pferde zeigten u. a. signifikant geringere Anteile von Lymphozyten zugunsten von (neutrophilen) Granulozyten im peripheren Blut, sowie größere Lymphozyten und Granulozyten. Auch stieg die spontane Sekretion von Tumornekrosefaktor (TNF)α, Interleukin (IL-) 4 und IL-10 aus PBMC signifikant mit dem Alter der Pferde, die in vitro Stimulierbarkeit dieser Zytokine durch Mitogene nahm hingegen ab.

Weiteren Einfluss auf systemische Biomarker der Immunreaktion hatte das Geschlecht der Pferde. Wallache wiesen signifikant kleinere Monozyten und eine höhere spontane Produktion von IL-10 durch PBMC auf als Stuten. Die Stimulationsrate (im Verhältnis zur Spontansekretion) wurde weiterhin vom (Rasse-)Typ der Pferde beeinflusst. Die Sekretion von TNFα, IL-4 und IL-17 aus PBMC von Warmblutpferden war in vitro stärker induzierbar als die aus PBMC von Vollblutpferden. Auch das basale Interferon γ / IL-4-Verhältnis ergab signifikant höhere Werte für Warmblut- als für Vollblutpferde.

Die Tageszeit der Probennahme beeinflusste nur geringgradig die Zusammensetzung der Leukozyten im peripheren Blut sowie deren Morphologie.

Die hier festgestellten physiologischen und methodischen Einflüsse auf die gemessenen Parameter wurden bei der Beurteilung der Behandlungseffekte nach Applikation SAINT-18-formulierter DNA berücksichtigt. Die Pferde waren gepaart randomisiert nach ihrer Fellfarbe und ihrem Alter als primären Kriterien und bei (sekundär) möglichst ausgewogener Verteilung von Geschlechtern und Typen in die Behandlungsgruppen eingeteilt. Veränderungen der Messwerte nach Behandlung wurden für systemische Messparameter auf die individuellen Baselines unter Berücksichtigung der Tageszeit relativiert.

Nach der vorgenommenen Einteilung in vier Gruppen à sechs Tiere wurden die Pferde gleichzeitig intramuskulär und intradermal mit MIDGE-Th1-Vektoren kodierend für IL-12 und IL-18 formuliert mit SAINT-18 oder Vergleichsmischungen (nur SAINT-18, SAINT-18 mit nicht-exprimierender MIDGE-Th1-DNA, SAINT-18 mit nicht-exprimierender MIDGE-Th1-DNA ohne CpG) verblindet behandelt. Zum internen Vergleich auf der lokalen Ebene wurde eine kontralaterale Stelle intradermal mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung behandelt. Die klinischen und zellulären Effekte wurden über 72 Stunden nach der Behandlung in länger werdenden Intervallen von sechs bis 24 Stunden untersucht.

Während keine schwerwiegenden Nebenwirkungen auftraten, wurden in allen Gruppen, die Behandlungen mit DNA erhielten, Behandlungseffekte im Vergleich zu den internen Kontrollen gemessen. Die Rektaltemperaturen dieser mit SAINT-18/DNA behandelten Pferde und Serum Amyloid A (SAA) in ihrem Blutserum waren erhöht. Die Gesamtleukozyten- und Neutrophilenzahl im Blut stiegen signifikant an, während die Lymphozytenzahlen abfielen. Die spontane ex vivo Sekretion von TNFα und Interferon (IFN) γ durch PBMC der Pferde war nach in vivo Behandlung höher als zu den Zeitpunkten der Baseline-Messungen, während die IL-10-Sekretion nach Behandlung mit SAINT-18/DNA sank. Mit SAINT-18/DNA behandelte Pferde wiesen signifikant höhere Anzahlen myeloider Zellen und eine höhere CXCL-10-Expression in Hautproben der intradermal behandelten Stellen auf, als Pferde, die nur SAINT-18 erhalten hatten.

Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass SAINT-18 formulierte MIDGE-Th1-DNA in vivo eine Entzündungsreaktion auf systemischer und lokaler Ebene hervorrief. Diese allgemeine Entzündungsreaktion stellte sich von Expression und CG-Gehalt der Vektoren unabhängig dar und wird vermutlich über intrazelluläre DNA-Rezeptoren vermittelt, die hochkonservierte Bestandteile in Säugerimmunsystemen sind.

Pferde, die IL-12/18-exprimierende SAINT-18 formulierte MIDGE-Th1-Vektoren erhalten hatten, zeigten die stärksten systemischen Entzündungsreaktionen, die sich in den Anstiegen der Rektaltemperaturen, Gesamtleukozyten- und Neutrophilenzahlen und den frühesten Abfällen der Lymphozytenzahlen im Blut äußerten. Weiterhin waren die deutlichsten und nur in dieser Gruppe statistisch signifikanten Anstiege von SAA zu verzeichnen. Lokal behandelte Hautproben dieser Pferde enthielten mehr IL-12 positive Zellen als Proben anderer Behandlungsgruppen. Des Weiteren war die CXCL-10-Expression signifikant gegenüber allen anderen Gruppen erhöht. Als nachgeschaltetes Signalmolekül zu den TH1-Zytokinen IL-12 und IFNγ deutet das lokal signifikant erhöhte CXCL-10 in Kombination mit der Deutlichkeit der allgemeinen Entzündungsreaktion in dieser Behandlungsgruppe auf eine rekombinante Expression von IL-12 in vivo durch SAINT-18 formulierte MIDGE-Th1-Vektoren in der vorliegenden Studie hin.

Einflüsse von Alter, Geschlecht und Typ der verwendeten Pferde auf die Behandlungseffekte korrelierten überwiegend mit denen vor der Behandlung und beeinflussten die Vergleichbarkeit der Behandlungsgruppen nicht entscheidend, da diese nach dem Alter der Tiere und unter Berücksichtigung von Typ und Geschlecht randomisiert eingeteilt worden waren.

Der Einfluss der Fellfarbe war für die Gruppeneinteilung ebenfalls berücksichtigt worden, obwohl dieser Faktor vor der Behandlung keinen Messparameter signifikant beeinflusst hatte. Schimmel zeigten allerdings nach der Behandlung mit SAINT-18/DNA einen signifikant geringeren Abfall der Lymphozytenzahlen. Ebenso waren die ex vivo TNFα-Sekretion von PBMC und die Infiltration myeloider Zellen in der tiefen Dermis im Vergleich zu Pferden anderer Farben vermindert. Aufgrund der deutlich schwächeren systemischen Immunantwort wurden diese Schimmel alle als Non-Responder auf SAINT-18/DNA eingestuft, obwohl Schimmel mit Melanomen in einer früheren Studie auf die Behandlung mit SAINT-18 formulierten MIDGE-Th1 kodierend für IL-12/18 mit partieller Tumorremission reagiert hatten. Ob die hier identifizierte unterschiedliche immunologische Reaktivität von Schimmeln im Vergleich zu Pferden anderer Farben zum erhöhten Risiko von Schimmeln beiträgt, Melanome zu entwickeln, sollte in weiteren Studien geklärt werden.

Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit die pro-inflammatorische Wirkung SAINT-18 formulierter MIDGE-Th1-DNA gezeigt, die unabhängig von der Expression der Vektoren und von deren CG-Gehalt auf systemischer und lokaler Ebene dargestellt werden konnte. Diese immunstimulatorische Eigenschaft könnte zu der antitumoralen Wirkung beitragen, die in einer vorherigen Arbeit demonstriert wurde.

Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Expression von rekombinantem IL-12 und IL-18 die Immunstimulation signifikant verstärkt und TH1-Zytokine und Chemokine induziert, deren antitumorale Eigenschaften in anderen Säugern demonstriert wurden.

Weitere Forschung ist wünschenswert, die für an Melanomen erkrankte Schimmel adäquate Biomarker charakterisiert. Die hier festgestellten Unterschiede zwischen Schimmeln und Pferden anderer Farben, die Einstufung von Schimmeln als Non-Responder, sowie Anzeichen für eine schwächere Immunreaktion der gesunden Pferde in der vorliegenden Arbeit im Vergleich zur vorherigen Arbeit an Melanom tragenden Schimmeln verhindern die einfache Übertragung der Erkenntnisse. Die Ursachen der unterschiedlichen Reaktion gesunder Pferde auf SAINT-18/IL-12/18-DNA bedürfen einer genaueren Analyse, wie auch die Mechanismen, welche den antitumoralen Effekt der Behandlung gegen Melanome bei Schimmeln vermitteln.

Die hier entwickelten Nachweismöglichkeiten, Beeinflussungen der Biomarker und die identifizierten Wirkmechanismen in gesunden Pferden können hilfreiche Ansatzstellen für die Identifizierung des Wirkmechanismus in erkrankten Tieren und die Weiterentwicklung der Therapie bieten.

abstract (englisch)

To investigate the mechanisms exerted by complexed minimalistic immunologically defined gene expression (MIDGE-Th1) vectors applied in vivo in horses, suitable biomarkers were evaluated, influencing factors were considered and treatment effects were identified at the systemic and local level in 24 healthy individuals.

Fifteen monoclonal antibodies specific for cytokines of different species were evaluated for reactivity with their corresponding equine cytokines by Dot Blot, Western Blot, immunohistochemistry and flow cytometry. Of these, ten reacted with four different equine cytokines in at least one of the applications.

Combining mAbs evaluated previously and in the present study, a panel of assays to detect candidate cytokines was chosen to evaluate responses to DNA treatments in combination with clinical, haematologic, flow cytometric and histologic evaluations.

To accurately employ the selected parameters as biomarkers for treatment effects, internal controls were included and evaluated for influencing physiological factors. Internal controls of systemic parameters were pre-treatment baseline measurements. The high inter-individual variances observed endorse the acquisition of individual baseline measurements to normalize treatment effects to these. The analyses conducted revealed that the age of the horses influenced leukocyte composition, cell morphology and cytokine release by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) ex vivo in healthy individuals. Older horses had lower percentages of lymphocytes and higher percentages of (neutrophilic) granulocytes compared to younger horses. The size of blood lymphocytes and granulocytes increased with age. PBMC of older horses spontaneously secreted more tumour necrosis factor (TNF) α, Interleukin (IL-) 4 and IL-10, but revealed lower relative inducibility of these cytokines after in vitro stimulation of PBMC by mitogens. Geldings had smaller monocytes and their PBMC showed a higher spontaneous ex vivo production of IL-10 when compared to mares. The stimulation to spontaneous release ratios of TNFα, IL-4 and IL-17 as well as the basal Interferon (IFN)γ/IL-4 ratio in Warmblood type horses exceeded those detected in Thoroughbred types. Sampling time influenced leukocyte composition and cell morphology only to a small extent.

These findings were considered for the evaluation of DNA treatment effects. The horses had been allocated to treatment groups with primary respect to colour and age. Secondarily, distributions of sex and breeds were regarded. Changes post-treatment were normalized to internal controls, usually matched for the respective sampling time.

Based on the allocations to four groups of six animals each, the horses were treated by simultaneous intradermal and intramuscular application of MIDGE-Th1 vectors encoding equine IL-12/-18 complexed with transfection reagent or comparative substances (transfection reagent only, complexed nonsense DNA, complexed nonsense DNA without CpG) in a prospective double-blind study. As an internal control for local effects, a different site was treated with phosphate buffered saline intradermally. The clinical and cellular responses of the horses were monitored over 72h following application.

Although no severe side-effects occurred, compared to individual baselines horses of all groups receiving DNA containing treatment showed systemic inflammatory responses. In these horses rectal temperatures were elevated after treatments and Serum Amyloid A (SAA) increased. Total blood leukocyte and neutrophil counts increased, while lymphocyte numbers decreased. In PBMC spontaneous ex vivo secretion of TNFα and IFNγ increased after treatments with DNA, while IL-10 secretion decreased. In skin samples of intradermal injection sites DNA-treated horses had significantly higher myeloid immune cell numbers and CXCL-10 expression compared to horses treated with transfection reagent only. Summarizing these findings, an inflammatory response to complexed linear DNA vectors at the systemic and local level was induced in vivo. This general inflammatory response appeared independent of expression and CG content of the applied DNA and is likely to have been mediateded via intracellular DNA receptors integrated in mammalian innate immune systems.

In horses treated with IL-12/18 expressing DNA however, the strongest systemic inflammatory effects were observed. These animals showed the highest elevations of RT, highest mean increases of WBC and neutrophil numbers, earliest decreases in lymphocytes and statistically significant rises of SAA. Moreover, immunohistochemistry of local skin samples revealed most IL-12 positive cells when compared to the other treatment groups, and local CXCL-10 expression was highest. As a downstream mediator of the TH1 cytokines IL-12 and IFNγ, CXCL-10, in combination with the most marked local and systemic effects, indirectly points towards an in vivo recombinant expression of IL-12 in horses treated with expressing MIDGE-Th1 vectors.

Influences on treatment effects of the age, sex and breed of the included horses were in partial agreement with those found in untreated horses and did not affect the comparison of treatment groups, as these had been balanced for the influencing horse factors.

The potential influence of the coat colour of the horses had been taken into account for group allocation as well, although this factor did not significantly influence any parameter pre-treatment. Interestingly, grey horses showed significantly fewer effects of DNA-treatments on blood lymphocyte counts, ex vivo TNFα secretion by PBMC and myeloid cell infiltration in the reticular dermis compared to non-grey horses. Based on a weaker systemic response post-treatment, the included healthy grey horses were all classified non-responders to immunostimulatory effects of complexed DNA, although in a previous study melanoma-bearing grey horses had responded to DNA treatment with complexed expressing vectors by partial tumour remission. Whether the different immunological reactivity of grey horses compared to horses of other colours found here may contribute to the susceptibility of grey horses to melanoma remains to be elucidated.

Summarizing the present results, the pro-inflammatory effect of complexed DNA independent of expression and CG content was characterized at the systemic and local level. This immunostimulatory property may contribute to previously observed antitumoural effects of the treatment. Moreover, expression of recombinant equine IL-12 and IL-18 enhances immunostimulation and induces TH1-biased downstream mediators, known to be antitumoural in other mammalian species.

However, further research on suitable parameters and exact mechanisms of DNA treatment in melanoma-bearing grey horses is desirable, as the characterization of healthy grey horses as non-responders with respect to non-specific inflammatory effects of complexed DNA and dissimilarities in the amplitude of effects compared to melanoma bearing horses hampers a simple transfer of the present results to mechanisms in antitumoural treatments. Nevertheless, the detection methods, influencing factors and biomarkers identified in healthy horses established in this study form a solid basis for supplementary research on equine immune responses to complexed DNA in clinical settings.

keywords

Melanom, Zytokine, Schimmel, melanoma, cytokines, grey horse

kb

20.515