Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Flavia Schmidt

Kombinationswirkungen

ausgewählter (Tri)Azol-Fungizide

in vivo und in vitro

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-111563

title (eng.)

Combination effects of selected (tri)azole fungicides in vivo and in vitro

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2018

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/schmidtf_ss18.pdf

abstract (deutsch)

Durch den Einsatz von Pflanzenschutzmitteln (PSM) in der Landwirtschaft können Lebensmittel mit verschiedenen Wirkstoffrückständen belastet sein. Verbraucher werden demnach über den Verzehr von belasteten Lebensmitteln mit einem variablen Cocktail an PSM-Rückständen unterhalb ihrer jeweiligen Grenzwerte exponiert. Die Risikobewertung im Rahmen des PSM-Zulassungsverfahrens erfolgt gegenwärtig separat für jedes einzelne PSM-Produkt. Hierbei werden zwar alle in diesem Produkt enthaltenen Inhaltsstoffe und deren potenzielle Wechselwirkungen bei der Abschätzung des Risikos miteinbezogen, unberücksichtigt bleiben jedoch die Wechselwirkungen mit anderen bereits zugelassenen PSM. Aufgrund einer Forderung der Europäischen Kommission arbeiten seit mehr als einem Jahrzehnt europäische und nationale Behörden sowie wissenschaftliche Institute an der Entwicklung geeigneter kumulativer Bewertungsmethoden und ihrer Implementierung in die regulatorische Praxis. Umfassende Daten zur Toxikologie und Exposition sind Voraussetzung für eine kumulative Risikobewertung von definierten Mischungen. Des Weiteren können experimentelle Arbeiten zur Mischungstoxizität von Wirkstoffgruppen dazu beitragen, die Eignung von computergestützten Verfahren zur kumulativen Risikobewertung zu testen.

 

            Für eine in der Landwirtschaft routinemäßig eingesetzte Fungizid-Klasse, die Triazole, sind Kombinationswirkungen in Hinblick auf ihren Einfluss auf das Hormonsystem sowie auf die Induktion von entwicklungs- und reproduktionstoxischen Effekten beschrieben. Potenzielle hepatotoxische Kombinationseffekte wurden bisher jedoch weitestgehend nicht untersucht. Des Weiteren ist unklar, inwieweit die in Nagetieren gut untersuchten hepatotoxischen Effekte der Triazole auch für den Menschen relevant sind. Vor diesem Hintergrund wurden im Rahmen dieser Dissertation ausgewählte Triazol-Fungizide und ein Imidazol-Fungizid, einzeln und in Kombination, in einer 28-Tage-Fütterungsstudie mit männlichen Ratten und in zwei Leberzelllinien (Ratte: H4IIE; Human: HepaRG®) hinsichtlich hepatotoxischer Kombinationseffekte auf transkriptioneller Ebene, unter Verwendung des Molecular Toxicology PathwayFinder PCR Array, untersucht und die Daten miteinander verglichen. Da zwar zahlreiche Studien zur Genexpression auf mRNA-Ebene nach Exposition gegenüber einzelnen Triazol-Vertretern vorliegen, potenzielle Effekte auf der Proteinebene jedoch nur unzureichend untersucht sind, wurde im Rahmen dieser Dissertation zusätzlich eine Proteomanalyse durchgeführt und die Ergebnisse mit den mRNA-Daten verglichen.

 

           Nach Exposition der Ratten gegenüber der NOAELx10-Dosis wurde eine Lebergewichtserhöhung, eine zentrilobuläre Hypertrophie, Anisonukleose und eine verstärkte Vakuolisierung in den Hepatozyten sowie eine Abnahme der Cholesterol-Konzentration im Blut beobachtet. Die Effekte auf molekularer Ebene, wie z.B. eine Induktion von zahlreichen Cytochrom-P-450-Enzymen und Veränderungen im Fettsäure-, Steroid- und Lipid-Metabolismus, korrelieren mit den oben genannten klassischen Toxizitätsparametern. Ein Vergleich der mRNA- und Protein-Expressionsdaten zeigt zudem Überlappungen für einzelne spezifische Pathways (Fremdstoff-, Fettsäure-, Steroid- und Lipidmetabolismus). Zusätzliche Pathways wurden jedoch anhand der 2D-Gelelektrophorese-Daten identifiziert (Aminosäuremetabolismus, Gluconeogenese). Der In-vivo-, In-vitro- und Spezies-Vergleich auf Basis der Array-Daten macht deutlich, dass die Triazole Epoxiconazol > Cyproconazol in den Rattenlebern einen stärkeren Einfluss auf die Anzahl deregulierter Gene hatten als das Imidazol Prochloraz. Im Gegensatz dazu veränderte Prochloraz in beiden Zelllinien die höchste Anzahl an Genen. Eine funktionale Analyse der deregulierten Gene offenbarte, dass in allen drei Studienobjekten (Rattenleber, H4IIE- und HepaRG®-Zellen) zahlreiche Gene verändert waren, die dem Fremdstoffwechsel oder der Leberspeicherstörung Phospholipidose zugeordnet werden können. Zudem waren einzelne Gene betroffen, die mit Steatose, Cholestase oder Fettsäuremetabolismus assoziiert sind. Es ist anzumerken, dass die Effekt-Richtung für alle deregulierten Gene in der Rattenleber und Rattenleberzelllinie übereinstimmte. Im Vergleich zu der humanen Leberzelllinie HepaRG® waren einzelne Gene unterschiedlich reguliert, sodass Speziesunterschiede zwischen Ratte und Mensch nicht auszuschließen sind. Insgesamt gesehen eignen sich beide Zelllinien zur Untersuchung der hepatotoxischen Effekte der (Tri)Azol-Fungizide. Die in den HepaRG®-Zellen identifizierten Effekte auf die Genexpression nach (Tri)Azol-Exposition waren überwiegend gut reproduzierbar. Kombinationseffekte der (Tri)Azole konnten sowohl in vivo als auch in vitro identifiziert werden. Hierbei wurden Effekte in den Kombinationen identifiziert, die nach Exposition gegenüber den Einzelsubstanzen nicht identifiziert werden konnten, oder aber nach Exposition gegenüber den Kombinationen im Vergleich zu den Einzelsubstanzen stärker ausfielen. Eine Charakterisierung der Kombinationswirkungen als dosis- oder effekt-additiv war aufgrund der experimentellen Bedingungen nur bedingt möglich.

abstract (englisch)

Due to the usage of plant protection products in agriculture, agricultural commodities can be contaminated with various residues of active substances. Therefore, consumers are exposed to a variable cocktail of residues of active substances, however generally below their respective regulatory limit values. The actual risk assessment procedure of plant protection products is carried out separately for each individual product. Although all compounds within one product and their potential combination effects are taken into account during risk assessment, potential interactions with other plant protection products are currently not taken into consideration. For more than a decade, european and national authorities as well as scientific institutes have been working on the development of suitable methods for risk assessment of chemical mixtures and their implementation in regulatory practice. Essential for an adequate risk assessment of mixtures are comprehensive data on toxicology and exposure of the mixture or single substances. Furthermore, experimental work on mixture toxicity can help to test the suitability of computer-assisted methods for cumulative risk assessment.

 

            For the triazoles, a routinely used fungicide class in agriculture, combined effects are described with regard to the endpoints hormone system as well as developmental and reproductive toxicity. However, potential hepatotoxic combination effects have not yet been studied extensively. Furthermore, it is unclear to what extent the hepatotoxic mechanisms of the triazoles, which are well studied in rodents, are also relevant for humans. Against this background, selected triazole fungicides and an imidazole fungicide, individually and in combination, were tested in vivo in a 28-day feeding study with male rats as well as in vitro in two liver cell lines (Rat: H4IIE; Human: HepaRG®) with regard to hepatotoxic combination effects. First, the experiments were performed at transcriptional level, using the Molecular Toxicology PathwayFinder PCR Array, and the results were compared with each other. Since effects induced by triazoles are insufficiently investigated at protein level, a proteome analysis was carried out using two-dimensional-gel-electrophoresis and triple-x-proteomics and the results were compared to the mRNA data.

 

            After exposure of the rats to the dose NOAELx10, several effects were observed like hepatic weight increase, centrilobular hypertrophy, anisotropy and increased vacuolization in the hepatocytes as well as a reduced cholesterol concentration in the blood. The effects at molecular level, as induction of numerous cytochrome-P-450-enzymes and changes in fatty acid, steroid and lipid metabolism, correlated with the non-molecular liver effects of the exposed animals. A comparison analysis of the mRNA and protein expression data revealed overlaps for single specific pathways (xenobiotic, fatty acid, steroid, and lipid metabolism). However, additional pathways were also identified at protein level (amino acid metabolism, gluconeogenesis). Comparison of the array data with respect to in vivo, in vitro and species differences showed that the triazoles epoxiconazole > cyproconazole had a stronger impact on the number of deregulated genes in rat liver than the imidazole prochloraz. In contrast, prochloraz altered the highest number of genes in both cell lines. A functional analysis of the deregulated genes revealed that in all three study objects (rat liver, H4IIE and HepaRG® cells), numerous genes were altered, which can be assigned to xenobiotic metabolism and phospholipidosis. In addition, single genes were affected which are associated with steatosis, cholestasis, or fatty acid metabolism. It should be noted that the effect direction coincided for all deregulated genes in the rat liver and rat liver cell line H4IIE. Compared to the human liver cell line HepaRG®, individual genes were regulated differently, so that species differences between rat and human cannot be ruled out. Overall, both cell lines are suitable for the investigation of hepatotoxic mechanisms of the (tri)azole fungicides. The effects on gene expression after (tri)azole exposure identified in the HepaRG® cells were predominantly reproducible. Combination effects of (tri)azoles could be identified both in vivo and in vitro, with effects being identified in the combinations that could not be identified after exposure to single substances, or which were more pronounced after exposure to the combinations compared to the individual substances. Due to the experimental conditions, a characterization of the combination effects as dose additive or effect additive was only possible to a limited extent.

keywords

Azole, Kombinationseffekte, Hepatotoxizität, azoles, combination effects, hepatotoxicity

kb

27.413