Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Friedrich Schlesinger

 

Pharmacokinetic properties of selective and non-selective AMPA-receptor antagonists and their role in neuroprotection

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-94990

title (ger.)

Pharmakokinetische Eigenschaften selektiver und nicht-selektiver AMPA-rezeptor-antagonisten und ihre Rolle in der Neuroprotektion

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2007

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/schlesingerf_ws07.pdf

abstract (deutsch)

In den vorliegenden Arbeiten wurden elektrophysiologische Untersuchungen an rekombinanten AMPA-Typ Glutamatrezeptoren durchgeführt. AMPA-Rezeptoren sind für die exzitatorische synaptische Transmission im zentralen Nervensystem  verantwortlich und stellen eine Untergruppe der ionotropen Glutamatrezeptoren dar. Sie sind postsynaptisch lokalisiert, wobei Rezeptor und Ionenkanal eine funktionelle Einheit bilden. Durch die Bindung von Glutamat an AMPA-Rezeptoren wird eine für Kationen selektiv permeable Zentralpore geöffnet. Hierbei kommt es in Bruchteilen von Sekunden zu hohen Glutamatkonzentrationen im synaptischen Spalt.

Vier verschiedene Untereinheiten (GluR1-4) von AMPA-Rezeptoren sind bekannt. Durch posttranskriptionelle mRNA-Editierung (R/G- und Q/R-Editierung) und alternatives Splicen (Flip- und Flop-Varianten) erhöht sich die Anzahl der verschiedenen Subtypen.

Die Q/R-Editierung existiert nur bei den GluR2-Untereinheiten und ist verantwortlich für die Regulation des intrazellulären Kalziumeinstroms. GluR2-Untereinheiten, die eine Editierung aufweisen sind impermeabel für Ca2+ -Ionen, während alle anderen Untereinheiten durchlässig für Kalziumionen sind. Die R/G-Editierung spielt eine wichtige Rolle in der Regulation der Desensitisierung und Resensitisierung. So zeigen editierte GluR2-Untereinheiten eine schnellere Kinetik in Bezug auf die Desensitisierung und Resensitisierung als die nicht-editierte GluR2-Untereinheit (Krampfl et al. 2002). Die Flip/Flop-Sequenz, die bei allen Untereinheiten vorkommt, ist ebenfalls an der Regulierung der Desensitisierung und Resensitisierung beteiligt, wobei die Flop-Varianten eine schnellere Desensitisierung als die Flip-Varianten aufweisen (Koike et al. 2000). AMPA-Rezeptoren kommen sowohl als homomere als auch als heteromere Rezeptoren vor.

Die in der vorliegenden Ph.D-These dargestellten Studie „Desensitization and    resensitization are independently regulated in human recombinant GluR subunit coassemblies” , Schlesinger et al. 2005,  wurden verschiedene AMPA-Rezeptor-Untereinheiten mit einander kombiniert und die Kinetik der einzelnen heterooligomeren Assemblierungen mit der Patch-Clamp-Technik untersucht. Hierbei konnte festgestellt werden, dass insbesondere die flip-Variante des GluR2 die Resensensitisierungskinetik dominiert, andere Parameter bleiben jedoch unbeeinflusst. Orientierend an der Arbeit von Mansour et al. 2001 wurde aufgrund dieser Eigenschaften eine bevorzugte Assemblierung von Rezeptoruntereinheiten postuliert.

Darüber hinaus wurde in der Arbeit “Two mechanisms of action of the adamantane derivative IEM-1460 at human AMPA-type glutamate receptors”, Schlesinger et al. 2005, die Wirkung des Adamantinderivates IEM-1460 an rekombinanten humanen homomeren AMPA-Rezeptoren sowie dem heteromeren GluR1o/2iGR-Rezeptor-Kanal untersucht. Die Experimente mit dem selektiven AMPA-Rezeptor-Antagonist IEM-1460 zeigten, dass die kalziumpermeablen homomeren GluR1o und GluR2iGQ eine signifikante Blockierung erfuhren. An dem kalziumimpermeablen homomeren GluR2iGR konnte kein signifikanter Effekt des IEM-1460 ausgemacht werden. Messungen am heteromeren GluR1o2iGR-Kanal zeigten ebenfalls keinen signifikanten Blockeffekt durch IEM-1460.

In einer weiteren Arbeit “Molecular analysis of the  interaction of the pyrazine derivatives RPR119990 and RPR117824 with human AMPA-type glutamate receptor channels”, Krampfl et al. 2006, wurden AMPA-Typ Glutamatrezeptorantagonisten RPR119990 und RPR117824 sowie ihre Wechselwirkungen an rekombinanten Glutamatrezeptoren auf molekularer Ebene untersucht. Für beide Substanzen, RPR119990 und RPR117824, konnten in verschiedenen experimentellen Untersuchungen mögliche neuroprotektive Eigenschaften nachgewiesen werden (Canton et al.,2001; Mignani et al.,2002). Bisherige pharmakologische Untersuchungen zeigten eine Wirksamkeit beider Substanzen als potente AMPA-Antagonisten im nanomolaren Konzentrationsbereich (Canton et al.,2001; Mignani et al.,2002).

Die Anwendung der Testsubstanzen am nicht-desensitiserenden AMPA-Rezeptor GluR2L504Y ermöglichte die weitere reaktionskinetische Charakterisierung der Blockmechanismen.

In Bezug auf die Pathophysiologie neurodegenerativer Erkrankungen, wie der amyotrophen Lateralsklerose, werden Desensitisierung, Resensitisierung und Kalziumpermeabilität der AMPA-Rezeptoren als wichtige Faktoren diskutiert. Ins- besondere der Glutamat-vermittelten Exzitotoxizität, die zu einem unkontrollierten Ca2+ -Ionen-Einstrom führt und somit einen „Circulus vitiosus“ zur Folge hat, wird eine besondere Bedeutung beigemessen. Die Arbeiten heben zum einen die spezifische Eigenschaften heterooligomerer Assemblierungen von AMPA-typ Glutamatrezeptoren hervor und  diskutieren ihre Bedeutung in Bezug auf die chronische Exzitotoxizität, zum anderen zeigen sie pharmakologische Angriffspunkte einer möglichen neuroprotektiven Therapie. Die Messdaten mit dem Adamantinderivat IEM-1460 zeigten eine selektive Blockierung kalziumpermeabler AMPA-Rezeptoren, was möglicherweise eine Therapiestrategie in der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen darstellen kann.

 

abstract (englisch)

In the study “Desensitization and resensitization are independently regulated in human recombinant GluR subunit coassemblies” , Schlesinger et al. 2005, we focused on desensitisation and resensitisation kinetics of different heteromeric GluR channels. A predominance of the fast resensitising over slow resensitising channels was shown when cDNA of GluR2 flip channels was cotransfected with that of GluR1 channels, referring to a preferential assembly. In contrast, when plasmids of GluR1 flip and GluR2 flip channels were cotransfected, we found a clear linear dependence of tD on the amount of the transfected cDNA.

 

However an inverse correlation between trec and the amount of the specific cDNA plasmids was found when GluR2 flip was cotransfected with GluR1 channels and in contrast to trec, tD had intermediate values at all combinations of heteromeric and homomeric channels  and was directly dependent on the amount of transfected cDNA. It is concluded from our data that desensitisation and resensitisation kinetics are regulated independently and are dependent on the specific subunit composition of the receptor.

In our study “Two mechanisms of action of the adamantane derivative IEM-1460 at human AMPA-type glutamate receptors”, Schlesinger et al. 2005 we tested the recently described glutamate receptor antagonist IEM-1460 for receptor interactions at the molecular level. IEM-1460 binds to Ca2+-permeable AMPA-type glutamate receptor channels and not to Ca2+-impermeable channels (Magazanik et al., 1997; Tikhonov et al., 2000). This means that currents through AMPA-type channels are blocked by IEM-1460 except the channels contain a Q/R edited GluR2 subunit which renders the respective channels Ca2+-impermeable.

 

IEM-1460 was nearly ineffective at GluR2 flip GR channels which have a very low Ca2+-permeability. This specific effect of IEM-1460 was clearly confirmed by the results of our study and it holds also true when low amounts of cDNA of GluR2 flip GR subunits are used for coexpression at HEK293 cells. The IC50 of native human AMPA-type channels (except GluR2 flip GR channels) was in the range of low sensitivity rat hippocampal neurons (Magazanik et al., 1997).

In an additional study “Molecular analysis of the  interaction of the pyrazine derivatives RPR119990 and RPR117824 with human AMPA-type glutamate receptor channels”, Krampfl et al. 2006, the two novel neuroprotective AMPA antagonists RPR119990 and RPR117824 were tested for their receptor interactions at the molecular level.

We could show that RPR119990 and RPR117824 block AMPA receptors competitively with an outstanding block activity as indicated by an IC50 in the low nanomolar range. The results hold true for different recombinant GluR channel subtypes. Especially the use of a non-desensitizing recombinant GluR channel enabled us to determine block mechanism and kinetics by co-application protocols. An IC50 value in the low nanomolar range for AMPA receptor channels in combination with a reduced potency on kainate receptors makes these compounds extremely interesting for a therapeutic use, as relevant blood concentration might be achieved and future studies should settle the issue of AMPA-antagonism in clinical neuropharmacology.

 

Our studies point out the exceptional position of the GluR2 flip subunits in dependence of the resensitisation-kinetic and discuss possible consequences focused on the model of chronic excitotoxicity. Additionally the importance of electrophysiological studies of antagonist of AMPA-receptors as a supportive tool for drug screening was discussed.

 

keywords

Neuroprotektion, AMPA-Rezeptorblocker, Exzitotoxizität; glutamate, AMPA, Patch clamp

kb

4.760