Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Jan Schinköthe

Experimental oral infection of goats with Mycobacterium avium subsp. hominissuis: Pathomorphological characterization of lesions in different

courses of disease with special focus on cellular composition of granulomas

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107603

title (ger.)

Experimentelle orale Infektion von Ziegen mit Mycobacterium avium subsp. hominissuis: Pathomorphologische Charakterisierung der Läsionen bei verschiedenen Krankheitsverläufen unter besonderer Berücksichtigung der zellulären Zusammensetzung der Granulome

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/schinkoethej_ws15.pdf

abstract (deutsch)

Ziegen wurden experimentell mit Mycobacterium avium subsp. hominissuis (MAH) infiziert, um die Spezifität von diagnostischen Antigenen gegen Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis zu testen. Hierfür wurde eine Gruppe von 21 Ziegen 10-mal, alle 2-4 Tage mit einer Gesamtdosis von 2,13 x 1010 KBE MAH oral inokuliert. Unerwartet traten bei 50% der Ziegen 2-3 Monate nach Erstinfektion (Mpi) schwere klinische Symptome auf und mehrere Tiere verendeten spontan oder mussten aus ethischen Gründen getötet werden. Die überlebenden Ziegen zeigten milde transiente klinische Symptome und waren bei der Sektion 13 Mpi klinisch gesund. Das erste Ziel dieser Studie war, die Läsionen sowohl bei den hochgradig Erkrankten als auch bei den überlebenden Ziegen zu charakterisieren und auf das Vorhandensein von MAH zu untersuchen.

Bei der Sektion wurden die makroskopischen Läsionen dokumentiert und repräsentative Proben von den Läsionen, intestinalen Geweben sowie lymphatischen und peripheren Organen entnommen und in Formalin fixiert bzw. kryokonserviert. Die histopathologische Analyse der Läsionen fand an HE-gefärbten Paraffinschnitten statt. Der Nachweis von MAH wurde mit Immunhistochemie (IHC) am Schnitt und mit bakterieller Kultivierung durchgeführt.

Ziegen zum Zeitpunkt 2-3 Mpi wiesen hochgradige intestinale Ulzerationen mit zugrunde liegenden granulomatösen Infiltraten in organisiertem Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (oGALT) und große Granulome in intestinalen Lymphknoten (ILN) auf. MAH konnte mit IHC in variabler Zahl intra- und extrazellulär nachgewiesen werden. Eine hohe Erregerlast wurde in intestinalen und ILN Läsionen sowie in peripheren Organen durch bakterielle Kultur festgestellt. Dies deutet auf eine extraintestinale Verbreitung von MAH hin. 13 Mpi wurden bei allen untersuchten Ziegen mehrere kleine Granulome in oGALT und/oder große Granulome in ILN bei der Sektion gefunden. MAH ließ sich nur in wenigen Granulomen (3/9 Ziegen) durch IHC nachweisen bzw. aus 6/9 Ziegen in geringen Mengen kultivieren. Alle infizierten Ziegen schieden bis 2 Mpi moderate bis hohe Mengen an MAH über den Kot aus. Die dabei eintretende Umgebungskontamination sowie das Vorhandensein von Mykobakterien in Granulomen von gesunden Ziegen könnte ein mögliches Risiko für die menschliche Gesundheit darstellen.

Da in den Ziegen 2-3 und 13 Mpi eine große Anzahl morphologisch heterogener Granulome gefunden wurde, war das zweite Ziel dieser Studie herauszufinden, wie die zelluläre Zusammensetzung der Granulome ist und diese mit denen bei der Tuberkulose der Rindes und des Menschen zu vergleichen. Dafür wurden in Konsekutivschnitten CD4+, CD8+, γδ-T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Plasmazellen, CD68+, CD25+, MHC-II+, proliferative Zellen und Endothelzellen mittels IHC markiert. Kollagen und säurefeste Bakterien (AFB) wurden mit Azan- bzw. Kinyounfärbung dargestellt.

Granulome mit extensiven verkäsenden Nekrosen, die minimale Mineralisierungen und viele AFB enthielten, waren umgeben von vielen CD4+ T Lymphozyten mit wenigen epitheloiden Makrophagen und waren nur in ILN 2-3 Mpi vorhanden. Diese Befunde wurden als überschießende Immunantwort interpretiert. Organisierte Granulome mit sehr wenigen AFB wurden in klinisch gesunden Ziegen 13 Mpi gefunden. Die nekrotischen Zentren dieser Granulome waren umgeben von einer Zone aus granulomatösem Infiltrat mit vielen epitheloiden Makrophagen und wenigen Lymphozyten. Diese Zone war zu Beginn breit und gut vaskularisiert. Sie wurde fortschreitend schmaler und stattdessen entwickelte sich eine immer breiter werdende Schicht aus Bindegewebe. Alle organisierten Granulome waren zusätzlich von organisiertem tertiärem lymphatischem Gewebe umgeben. Die Heterogenität der Granulome bei MAH infizierten Ziegen zeigte eine große Ähnlichkeit mit Granulomen der Tuberkulose des Rindes und des Menschen.

Die verschiedenen Krankheitsverläufe mit Latenzphase, das Auftreten von morphologisch heterogenen Granulomen und die Entwicklung von tertiärem lymphatischem Gewebe in organisierten Granulomen machen die experimentelle Infektion der Ziege mit MAH zu einem für die vergleichende Forschung an Infektionen mit tuberkulösen und nicht tuberkulösen Mykobakterien hervorragend geeigneten Modell.

abstract (englisch)

Goats were experimentally infected with Mycobacterium avium subsp. hominissuis (MAH) to determine the specificity of diagnostic antigens for Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. For this, each of 21 goats was inoculated orally 10-times, every 2-4 days with MAH receiving a total dose of 2.13 x 1010 cfu MAH. An unexpected onset of clinical signs progressing to severe disease was observed in 50 % of the goats at 2-3 mpi. The remaining goats had mild transient clinical signs and were healthy 13 mpi at the end of the trial. The first objective of this study was to characterize lesions in severely sick goats and in surviving goats at 13 mpi and to examine lesions for presence of MAH.

At necropsy, goats were examined for macroscopic lesions. Representative samples of lesions, intestinal tissues, lymphoid organs and large parenchyma were fixed in NBF and snap frozen. Histologic lesions were evaluated in HE stained FFPE sections. Detection of MAH in sampled tissues was performed by IHC and by bacterial cultivation.

Goats necropsied at 2-3 mpi had severe intestinal ulcerations with underlying granulomatous infiltrates in oGALT and large granulomas in ILN with variable quantities of MAH detected in tissue sections. Large amounts of MAH were cultivated from intestinal and ILN lesions and peripheral organs, indicating extra-intestinal spread of MAH. At 13 mpi, multiple small granulomas in oGALT and large granulomas in ILN were seen at necropsy. MAH was detected by IHC in few granulomas (3/9 goats) and cultured in low quantities in 6/9 goats at intestinal sites and ILN only. All goats excreted moderate to high amounts of MAH via feces until 2 mpi. Environmental contamination due to fecal shedding and low amounts of mycobacteria in granulomas of otherwise healthy goats may represent a potential risk for human health.

Since large numbers of morphologically heterogeneous granulomas were found in goats at 2-3 mpi and 13 mpi, the second objective was to characterize their cellular composition and to compare them with granulomas seen in human and bovine tuberculosis. In consecutive frozen sections, CD4+, CD8+, γδ T lymphocytes, B lymphocytes, plasma cells, CD68+, CD25+, MHC-II+, proliferative and endothelial cells were labeled by IHC. Furthermore, collagen and AFB were stained by Azan, respectively, Kinyoun method.

Granulomas with extensive necrosis, little mineralization and variable numbers of AFB surrounded by many CD4+ T cells, but only few epitheloid macrophages were observed in severely sick goats at 2-3 mpi. They were interpreted as exuberant immune reaction. Organized granulomas with very few AFB were seen in clinically healthy goats at 13 mpi. The necrotic cores were surrounded by a zone of granulomatous infiltrate with many epitheloid macrophages and few lymphocytes. This zone was initially wide and highly vascularized and became progressively smaller. It was enclosed by an increasing layer of connective tissue. All organized granulomas were surrounded by compartimentalized tertiary lymphoid tissue. The granulomas in experimental infection of goats with MAH reflect the heterogeneity of lesions seen in mycobacterial infections of humans and ruminants.

In conclusion, the experimental infection of goats with MAH resulted in different courses of disease, morphologically different granulomas with striking similarities to those seen in bovine and human TB, and the development of ectopic lymphoid tissue in organized granulomas. These features highlight this model as appropriate for comparative TB and NTM research and the goat in particular as model species.

keywords

Ziege; Pathologie; Mycobacterium avium subsp. hominissuis, goat; pathology; Mycobacterium avium subsp. hominissuis

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