Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Henning Christian Schenk

 

Electrophysiological Studies of the Motor Unit in the Bovine and Canine Species

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-94338

title (ger.)

Elektrophysiologische Untersuchungen der Motorischen Einheit an Rindern und Hunden

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2007

text

/dissertations/schenkh_ss07.pdf

abstract (deutsch)

In der Tierneurologie werden zur Untersuchung von Erkrankungen der motorischen Einheit Spezies-spezifische Methoden benötigt. In Abhängigkeit von der Spezies bestehen unterschiedliche Fragestellungen zur Diagnosestellung von Krankheiten der motorischen Einheit. Ziel der vorliegenden Studie ist die Entwicklung von neuen funktionellen Untersuchungstechniken zur Abklärung von Erkrankungen der motorischen Einheit beim Hund und beim Rind. Die vorliegende Arbeit wurde in zwei Teile geteilt.

Da beim Rind periphere Nervenlähmungen die häufigste neurologische Erkrankung darstellen und keine adäquaten elektrodiagnostischen Methoden zur Verfügung stehen, war das Ziel im ersten Teil dieser Arbeit die Etablierung von Referenzwerten für die motorische Nervenleitgeschwindigkeit (mNLG) bei Kälbern. Zu diesem Zweck wurde die mNLG des N. radialis und des N. ischiadicus/ fibularis an 20 gesunden Kälbern (Alter zwischen 16 und 85 Tagen) gemessen. Die mittlere mNLG des N. radialis lag bei 48,3 Meter/ Sekunde (m/s) mit einer Standardabweichung (SD) von ± 10,6 m/s. Beim N. ischiadicus/ fibularis wurde eine mittlere mNLG von 83,8 m/s ± 5.9 SD festgestellt. Mittels einer Varianzanalyse der erhobenen Daten konnte dargestellt werden, dass die mNLG des N. ischiadikus/ fibularis signifikant (p < 0,0001) schneller ist als die des N. radialis. Zur Präzisionskontrolle der eingesetzten Meßmethode wurden bei einer Gruppe von sechs Kälbern an fünf aufeinander folgenden Tagen wiederholte Messungen der mNLG vorgenommen. Mittels einer Varianzkomponentenzerlegung dieser Daten konnte dargestellt werden, dass der Faktor „individuelles Kalb“ und der Faktor „Tag der Messung“ einen größeren Einfluss auf die Messung der mNLG des N. radialis als auf die des N. ischiadicus/ fibularis haben. Daraus kann gefolgert werden, dass die Messwerte der mNLG des N. ischiadicus/ fibularis eine höhere Präzision aufweisen als die des N. radialis. Eine mögliche Erklärung für diesen Zusammenhang könnte der anatomisch bedingte, kurze Abstand zwischen der proximalen und distalen Stimulation Stelle des N. radialis beim Kalb sein (4 -7 cm). Im Rahmen von zukünftigen klinischen Untersuchungen von Erkrankungen des peripheren Nerven beim Kalb sollte die höhere Genauigkeit der mNLG Messungen am N. ischiadikus/ fibularis berücksichtigt werden. Bei den durchgeführten Messungen ließ sich kein Einfluss des Alters der Kälber auf die mNLG nachweisen.

Um die elektrophysiologischen Daten mit morphologischen Parametern vergleichen zu können, wurden bei eine weiteren Gruppe von sechs Kälbern Nervenbiopsien des N. ischiadicus/ fibularis nach Messung der mNLG entnommen. Die Nervenbiopsien wurden in Epoxid-Harzblöcke eingebettet. Von diesen Blöcken wurden transversale Semidünn-Schnitte angefertigt, die anschließend zur Darstellung der Myelinscheide für fünf Minuten mit 1% Paraphenylendiamin gefärbt wurden. Auf digitalisierten Bildern dieser Schnitte wurden die Parameter Faserfläche, Faserdurchmesser, Axonfläche, Axondurchmesser, Myelinscheidendicke und die g-ratio mittels der Analy-SIS ProR Software erhoben. Der durchschnittliche Faserdurchmesser (Mittelwert 8,40 µm ± 2,80 SD, Spannweite 1,98 – 17,90 µm) und die durchschnittliche g-ratio von allen Kälbern wurden benutzt, um Vergleiche mit andern Spezies durchzuführen. Keine der Tierarten vergleichbaren Alters, bei denen bisher diese Parameter erhoben worden sind (z.B. Hunde, Pferde, Schafe), wies derartig hohe Werte bezüglich des Faserdurchmessers und der g-ratio auf. Es lässt sich zusammenfassen, dass die erhobenen Referenzwerte der relativ schnellen mNLG bei Kälbern gut mit den untersuchten morphologischen Parametern korrelieren. In Anbetracht der schnellen mNLG und des dicken Faserdurchmessers scheinen Kälber bezüglich der Entwicklung peripherer Nerven wesentlich reifer zu sein als Hunde, Pferde, Schafe, Katzen und Menschen gleichen Alters.

Bei der Spezies Hund stellt die Erforschung neuromuskulärer Erkrankungen einen wachsenden Forschungsbereich dar. Die Elektromyographie und Messungen der mNLG sind schon seit Jahrzehnten bei dieser Spezies zur funktionellen Untersuchung von neuromuskulären Erkrankungen etabliert. Die Entwicklung von elektro-physiologischen Untersuchungsmethoden an caninen Muskelzellenkulturen mittels der Patch Clamp Technik wäre ein neuer Ansatz, um funktionelle Komponenten von neuromuskulären Erkrankungen zu erfassen. Daraus leitet sich das Ziel des zweiten Teils dieser Studie ab, eine canine Muskelzellenkultur, gewonnen aus Muskelbiopsien, zu etablieren. Im Rahmen von Routineoperationen wurden aus verschiedenen Muskeln von Hunden (n = 16) Muskelbiopsien entnommen. Die Biopsien wurden für die Dauer von ein bis drei Tagen bei 4°C in einem sterilen Transportmedium gelagert, um Versandbedingungen zu simulieren. Anschließend an die Lagerung wurden die Biopsien zu Zellkulturen weiterverarbeitet. Dies beinhaltet das Herauslösen der Zellen aus dem Gewebsverband, die Trennung der muskulären Satellitenzellen von den Fibroblasten mittels Differenzierungszentrifugation, die Induktion von Proliferation und schließlich die Differenzierung der gewonnenen Zellen zu Myotuben mittels spezieller Medien. Darüber hinaus wurde auch eine Methode zur Rekultivierung von caninen Muskelzellen im Anschluss an eine Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff erfolgreich erprobt. Die Muskelzellen wurden mittels Immunofluoreszensfärbungen (n = 4), immunhistologischen Färbungen (n = 2) und durch ihre typische Morphologie im differenzierten Zustand (n = 8) identifiziert. Bei beiden Färbemethoden wurde als primärer Antikörper ein monoklonaler Antikörper gegen das muskelspezifische Intermediärfilament Desmin eingesetzt. In den Primärkulturen betrug der Anteil der Muskelzellen zwischen 60 – 80%, wohingegen dieser Anteil bei den rekultivierten Kulturen bei 40 – 60% lag.

Die in vorliegender Studie etablierten Methoden ermöglichen den Zugang zu bisher ungenutzten funktionellen Untersuchungen neuromuskulärer Erkrankungen beim Hund. Funktionelle Studien auf molekularer Ebene werden durch diese Zellkulturtechnik ermöglicht. Darüber hinaus wird durch diese Zellkulturtechnik die Grundlage für die in vitro Entwicklung von therapeutischen Ansätzen ermöglicht. Da gezeigt werden konnte, dass Muskelzellkulturen auch nach Versand von Muskelbiopsien angelegt werden können, besteht nun die Möglichkeit Muskelbiopsien von erkrankten Hunden aus ganz Europa zu sammeln und eine canine Muskelzellbank zu begründen. Durch diese Materialquelle werden weiterführende Untersuchungen unterschiedlicher Rezeptoren und Ionenkanäle mittels der Patch Clamp Technik realisierbar.

 

abstract (englisch)

The diagnostic evaluation of motor unit diseases in veterinary neurology requires species-specific functional examination methods. For each species different clinical demands exist in order to diagnose diseases of the motor unit. The aim of the current study was the development of new functional examination techniques for the evaluation of motor unit diseases in cattle and dogs. The study was divided in two parts.

The purpose of the first part of the study was the establishment of reference values for the motor nerve conduction velocity (mNCV) in calves as peripheral nerve injuries are the most frequent neurological disorders in cattle. The mNCV of the N. radialis and the N. ischiadicus/ fibularis was measured in 20 healthy calves (ages ranging from 16 to 85 days). The mean value of the mNCV of the N. radialis was 48.3 metres/second (m/s) ± 10.6 standard deviation (SD), while the mean value of mNCV of the N. ischiadicus/ fibularis was 83.8 m/s ± 5.9 SD. Variance analysis of this data revealed that the mNCV of the N. ischiadicus/ fibularis is significantly (p < 0.0001) faster than the N. radialis. In order to evaluate the reliability of the technique used repeated measurements were performed on a group of six calves on five consecutive days. A variance components analysis of the obtained data revealed that the individual calf and the day of measurement have greater influences on the mNCV of the N. radialis than on that of the N. ischiadicus/ fibularis. Therefore, it is concluded that the mNCV measurements of the N. ischiadicus/ fibularis are more reliable than those of the N. radialis. A possible explanation for these results could be the anatomically determined short distance between the proximal and distal stimulation of the N. radialis (4 - 7 cm). In a clinical setting the better reliability of the mNCV of the N. ischiadicus/ fibularis should be considered in future studies.

An influence of the age of the examined calf on the mNCV could not be determined. Nerve biopsies from a group of six calves (ages ranging from 14 to 30 days) were taken to correlate the obtained electrophysiological data with morphological parameters. Biopsies were embedded in epon and semi-thin transverse sections were cut. These sections were mounted on uncoated glass slides and stained with 1% paraphenylendiamine solution for 5 minutes to stain the myelin substance. Digitized images of the slices were manually evaluated with the Analy-SIS ProR software. In the cross-sectioned samples of the N. fibularis fascicle area the total number of fibres per fascicle, fibre density, fibre area, fibre diameter, axon area, axon diameter, myelin sheath thickness and the g-ratio were obtained. The average fibre diameter (mean value 8.40 µm ± 2.80 SD, range 1.98 µm to 17.90 µm) and the average g-ratio (0.61 ± 0.04 SD) of the calves were used for comparison with other species. None of the previously evaluated species (dogs, horses, sheep) of comparable age demonstrated such high fibre diameters and such low values for the g-ratio. In conclusion, the established reference values of the mNCV in calves correlate well with the evaluated morphometric parameters. Due to comparably fast mNCV and the high fibre diameters juvenile calves appear to be much more mature individuals than dogs, horses, sheep, cats and humans.

In dogs research into neuromuscular disorders is a growing field. Electromyography and mNCV measurements are well-established in this species as functional diagnostic methods. The development of electrophysiological examinations of canine muscle cells on a molecular level with the patch clamp technique would be a new approach in order to elucidate functional components of canine neuromuscular disorders. Therefore, the aim of the second part of this study was the development of a canine muscle cell culture derived from muscle biopsies of healthy dogs. Biopsies were taken during standard surgical procedures from various muscles of dogs (n = 16), stored for one to three days at 4°C in a special transport medium in order to simulate shipping conditions and were processed afterwards. The processing included harvesting of cells, separation of satellite cells from fibroblasts by special centrifugation steps, induction of proliferation, and differentiation to myotubes using special culture media. In addition, a method for recultivation of myotubes after long-term storage in liquid nitrogen was evaluated. The myogenic cells in all cultures were identified as muscle cells by immunofluorescence (n = 4), immunohistology (n = 2) and by their typical morphology after induction of differentiation (n = 8). Immunofluorescence and immunohistology were performed with a mononuclear antibody directed against the muscle specific intermediate filament desmin. The percentage of muscle cells in the primary cultures ranged from 60 %- 80 %, whereas the recultivated cultures demonstrated 40 % - 60 % muscle cells. These methods offer possibilities to elucidate the pathomechanisms of so far unknown disease entities on a molecular level and might be the basis for the in vitro development of new treatment strategies. A collection of biopsies from locations all over Europe and the foundation of a canine muscle tissue bank are feasible using this new technique. Furthermore, functional studies of different receptors with the patch clamp technique and molecular biologic research can be performed with this new raw material.

 

keywords

Muskelzellkultur, periphere Nerven, Morphometrie, muscle cell culture, peripheral nerves, morphometry

kb

9.714