Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Hannah Christina Scheiblich

Nitric oxide (NO)- and carbon monoxide (CO)-mediated signal transduction in a co-culture system of microglia and human model neurons

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107595

title (ger.)

Stickstoffmonoxid (NO)- und Kohlenmonoxid (CO)-vermittelte Signaltransduktion in einem Ko-Kulturmodell aus Mikroglia und humanen Modellneuronen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/scheiblichh_ws15.pdf

abstract (deutsch)

Entzündungsprozesse im Gehirn, die im Wesentlichen mit der Aktivierung spezieller Immunzellen, den sogenannten Mikroglia einhergehen, spielen bei einer Vielzahl neurodegenerativer Erkrankungen eine wesentliche Rolle. Mikroglia sind die residenten Immuneffektorzellen des Zentralnervensystems (ZNS), deren Funktion in der immunologischen Überwachung des Nervengewebes liegt. Infolge pathologischer Veränderungen initiieren Mikroglia eine Reihe an zellulären Immunantworten, die als Verteidigungsstrategie und somit dem Schutz des ZNS dienen. Dennoch ist die Aktivierung der Mikroglia während inflammatorischer Prozesse als kritisch zu beurteilen, da eine fehlerhafte Regulierung der mikroglialen Immunantwort die Pathogenese neurodegenerativer Prozesse verschlimmern kann. Ziel dieser Arbeit war es, die Relevanz von Stickstoffmonoxid (NO) und Kohlenmonoxid (CO) sowie ihrer vermittelnden Signaltransduktionswege auf die Regulierung zellulärer Reaktionen der Mikroglia zu untersuchen.

Um das Migrationsverhalten der Mikroglia sowie die regulatorischen Effekte von NO und CO auf die Zellmigration zu erforschen, habe ich einen in vitro Versuchsansatz verwendet, bei dem das Einwandern der Zellen in eine Kratzwunde quantifiziert wurde. Dabei wurden Zellen der murinen mikroglialen Zelllinie BV-2 sowie primäre Mikroglia aus der Ratte untersucht und miteinander verglichen. Die Charakterisierung des Migrationsverhaltens erfolgte durch den Einsatz einer Reihe von pharmakologischen Wirkstoffen, die den NO/cGMP- sowie den HO-1/CO-Signalweg auf verschiedenen Ebenen der Signaltransduktion manipulieren. Meine Ergebnisse weisen deutliche Evidenzen auf, dass NO durch die Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) die Bildung von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) stimuliert und so die mikrogliale Zellmigration fördert. Im Gegensatz dazu habe ich durch die Aktivierung der Hämoxygenase-1 (HO-1) sowie die Applikation eines CO-freisetzenden Moleküls (CORM) die HO-1/CO-Kaskade als einen antagonistischen Modulator der NO/cGMP-Signaltransduktion bei der Regulierung der mikroglialen Zellmigration identifiziert. Trotz einiger Unterschiede bezüglich der Konzentrationsbereiche, in denen die pharmakologischen Wirkstoffe eingesetzt werden mussten, konnte die mikrogliale Zelllinie BV-2 als geeignetes Modellsystem etabliert werden, um den Einsatz primärer Mikroglia in unseren Versuchsansätzen zu reduzieren.

In einem weiteren Teil dieser Arbeit habe ich den Fokus auf die regulatorischen Effekte und die Wechselbeziehung zwischen NO und CO während der Regulierung der Aktivierung und Phagozytose von Mikroglia gelegt. Meine Ergebnisse zeigen, dass Stimulation der Mikroglia mittels Lipopolysacchariden (LPS) zu einer deutlich gesteigerten NO-Freisetzung durch Aktivierung der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) führt. Durch Aktivierung des CO-generierenden Enzyms HO-1 sowie den Einsatz von CORM konnte die LPS-induzierte iNOS Expression und NO-Produktion vollständig geblockt werden. Um die Regulierung der Phagozytose der Mikroglia zu charakterisieren habe ich einen Phagozytose-Assay entwickelt, bei dem Mikroglia und humane Modellneurone ko-kultiviert wurden. Ich konnte zeigen, dass exogenes NO nicht nur die iNOS zur endogenen NO-Produktion stimuliert, sondern auch die Phagozytose-Aktivität der Mikroglia durch Selbststimulation erhöht. Durch Induktion der HO-1 sowie eine Behandlung mit CORM konnte ich erstmals zeigen, dass der HO-1/CO-Signalweg die Phagozytose-Aktivität der Mikroglia unter akuten Entzündungsbedingungen deutlich herunter reguliert.

In einem Versuchsansatz zur Bestimmung des Neuritenwachstums, führte die Aktivierung der Mikroglia mittels LPS zu einer Inhibition der auswachsenden Neuriten benachbarter humaner Modellneurone. Diesem inhibitorischen Effekt konnte durch die Induktion der HO-1 sowie der Zugabe von CORM vollständig entgegengewirkt werden. Da kein direkter Zell-Zell-Kontakt zwischen Mikroglia und Neuronen für die Inhibition des Neuritenwachstums erforderlich war, stellten wir die Hypothese auf, dass diffusionsfähige Faktoren zu diesem negativen Effekt führen müssen. In weiteren Analysen konnte ich zeigen, dass NO, welches von Mikroglia freigesetzt wird, für den hemmenden Effekt auf das Neuritenwachstum ko-kultivierter Neurone verantwortlich war.

Im abschließenden Teil dieser These wiesen unsere Ergebnisse deutliche Evidenzen auf, dass der hemmende Effekt auf das Neuritenwachstum auf einer nachgeschalteten Ebene der NO- und CO-Signaltransduktion reguliert werden könnte, nämlich über die RhoA (Ras homolog gene family, member A GTPase) / ROCK (Rho-associated coiled coil forming protein serine/threonine kinase) - Signalkaskade. Behandlungen mit Inhibitoren des RhoA/ROCK-Signalwegs, wie beispielsweise dem gängigen Schmerzmittel Ibuprofen, führten zu einer verminderten RhoA-Aktivität und förderten so das Neuritenwachstum der humanen Neurone. Umgekehrt führte die Aktivierung des RhoA/ROCK-Signalwegs zu einem Zusammenfall des Wachstumskegels.

Die vorliegende Arbeit bietet fundamentale Einblicke in die Signaltransduktionsmechanismen, die der Regulierung verschiedener zellulärer Immunantworten von aktivierten Mikroglia via NO und CO zu Grunde liegen. Mit Hilfe dieses Wissens könnte es möglich werden, die Mikroglia als Schlüssel für die Entwicklung effizienter Therapiestrategien bei der Behandlung neurodegenerativer und neuroinflammatorischer Erkrankungen des ZNS zu bestimmen. 

abstract (englisch)

Inflammation within the brain is usually accompanied by the activation of microglia and is commonly associated with various neurodegenerative diseases. Microglia are the resident immune effector cells of the central nervous system (CNS), initiating a range of cellular responses for host defense upon recognizing damage or danger signals. However, it is widely accepted that microglia play a dual role in mediating the immune response since it has been shown that failed regulation of microglial activation can exacerbate the progression of neurodegeneration. The aim of this thesis was to investigate the regulation of different cellular characteristics of activated microglia in response to the two gaseous messenger molecules nitric oxide (NO) and carbon monoxide (CO).

In the first part of this thesis, mechanistic links between lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, NO signaling, microglial activation, and cell migration were explored in an in vitro approach of cells from the microglial cell line BV-2 and rodent primary microglia. The migration pattern of BV-2 cells versus primary microglia was investigated by employing small bioactive enzyme activators and inhibitors of the NO/cGMP signaling cascade. Despite some differences in the threshold towards stimulation with the chemical agents, it could be demonstrated that NO positively regulates the cell migration of microglia via cyclic guanosine monophosphate (cGMP), thereby leading to cytoskeletal rearrangement. Moreover, the microglial cell line BV-2 was established as an adequate model system for primary microglia.

The second part of this thesis evaluated the regulatory effects and cross-talk between NO and CO on certain aspects of microglial biology, including activation, migration, phagocytosis and neuron-interaction. Data from my cell culture model show that LPS-stimulated microglia increase their NO production via activation of the inducible NO synthase (iNOS), resulting in an increase in their phagocytotic activity through self-stimulation by a mechanism independent of the sGC/cGMP pathway. Stimulation of the CO-generating enzyme heme oxygenase-1 (HO-1) and application of a CO-donor prevented the production of NO during LPS stimulation, and attenuated microglial migration, and phagocytosis in a model of acute inflammation. LPS activation of microglia inhibited the neurite outgrowth of adjacent human neurons, but the neurite outgrowth reduction could be antagonized by addition of a CO-donor or induction of HO-1. Since LPS stimulation of microglia affected the neurite length of adjacent neurons without required cell-cell contact, the effects were mediated by diffusible factors. One likely candidate is NO which is released in excessive amounts upon LPS-stimulation of microglia and slowed the neurite outgrowth of co-cultured neurons.

Finally, in the third part of this thesis evidence has been found that the neurite outgrowth retarding effect seems to be regulated downstream of NO and CO via the RhoA (Ras homolog gene family, member A GTPase) / ROCK (Rho-associated coiled coil forming protein serine/threonine kinase) signaling cascade. Treatment with RhoA/ROCK inhibiting agents, like the common pain reliever Ibuprofen, greatly decreased RhoA activation and promoted neurite outgrowth of human neurons. Conversely, activation of RhoA/ROCK resulted in growth cone collapse.

Taken together, the present thesis provides first insights how cellular responses of microglia are modulated by the two gases NO and CO and the underlying molecular signal transduction mechanisms.

keywords

Zellmigration, Phagozytose, Neuritenwachstum // cell migration, phagocytosis, neurite outgrowth 

kb

1.605