Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Jana Schäfer

 

Steigerung der Kältetoleranz von Eberspermatozoen

durch Modifikationen im Prozessablauf der Tiefgefrierkonservierung

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110147

title (eng.)

Improving cryotolerance of shipped boar semen by modifications in the cryopreservation procedure

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/schaeferj_ss17.pdf

abstract (deutsch)

Die Kältesensibilität von Eberspermatozoen stellt ein grundlegendes Problem für die Kryokonservierung von Sperma dieser Tierart dar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, über die Modifikation ausgewählter Verarbeitungsprozesse bei der Tiefgefrierkonservierung von dezentral gewonnenem und über Nacht zum Labor transportiertem Ebersperma eine erhöhte Kältetoleranz und somit eine bessere Qualität aufgetauter Eberspermatozoen zu erreichen.

Insgesamt wurden vier modular aufeinander aufbauende Versuche durchgeführt. Die Ergebnisse eines Versuches wurden jeweils in den Ablauf der Folgeversuche implementiert. So konnte eine kontinuierliche Optimierung des Verfahrens vorgenommen werden. Alle Ejakulate wurden auf derselben Eberstation gewonnen, 1+1 (v/v) mit Beltsville thawing solution verdünnt und innerhalb von 20 Stunden zum Labor geliefert. Dort erfolgten die Untersuchung der Qualität vorverdünnter Ejakulate, die Tiefgefrierkonservierung im „split sample“-Verfahren und die Qualitätskontrolle aufgetauter Proben. Die Beurteilung der Qualität fand sowohl mikroskopisch als auch mittels CASA (AndroVision®, Minitüb, Deutschland) und Durchflusszytometrie (Accuri C6, BD Biosciences, Belgium) statt. Die Spermienmorphologie wurde bei Probeneingang und die Akrosomintegrität nach dem Auftauen mikroskopisch beurteilt. Die Motilitätsanalyse erfolgte nach 10-minütiger Inkubation bei 38 °C. Zusätzlich wurden bei aufgetauten Proben Messungen nach 30 und 120 Minuten vorgenommen. Die durchflusszytometrische Erfassung der Chromatinstabilität (SCSA), der plasmamembranintakten, mitochondrienaktiven Spermatozoen (PI neg., R123 pos.) sowie der plasmamembran- und akrosomintakten Spermatozoen (FITC-PNA neg., FITC-PSA neg., PI neg.) lieferte zusätzliche Aussagen zur Qualität.

Im ersten Versuch wurde die dem 20-stündigen, isothermen Transport angeschlossene Haltezeit bei 17 °C variiert. Es erfolgte ein Vergleich zwischen einer 2-stündigen Haltezeit, welche die Dauer der Eingangsuntersuchung abdeckte und einer 24-stündigen Haltezeit bei 17 °C. Bei Verarbeitung nach 2-stündiger Haltezeit blieben die Auftaumotilität und die Geißelschlagfrequenz signifikant besser erhalten.

Die Durchführung des zweiten Versuches sollte Aufschluss über die kryoprotektiven Eigenschaften von Trehalose und Androstar® CryoPlus (Minitüb, Deutschland) im Vergleich zur üblicherweise genutzten 11 %igen Laktoselösung geben. Die Aufbereitung von Androstar® CryoPlus erfolgte nach Herstellerangaben. Trehalose wurde als 300 mM Lösung verwendet. Der Einsatz von Androstar® CryoPlus erbrachte eine signifikant geringere Spermaqualität als das Laktose- und Trehalosemedium. Trehalose und Laktose zeigten mit einer Auftaumotilität von jeweils über 40 % gute kryoprotektive Eigenschaften. Der Anteil plasmamembran- und akrosomintakter Spermatozoen blieb bei Verwendung von Laktose tendenziell höher erhalten als bei Trehalose.

Der dritte Versuch diente dem Vergleich einer kurzen (2 und 4 Stunden) und längeren (24 und 48 Stunden) Äquilibrierungsdauer im Kühlverdünner bei 5 °C. Neben anderen Parametern war die Auftaumotilität bei 4-stündiger Äquilibrierung jener nach 2, 24 und 48 Stunden Äquilibrierung überlegen.

Im vierten Versuch erfolgte ein Zusatz von Zinksulfat-Heptahydrat zum Kühl-, Gefrier- und Auftauverdünner. Es wurden Verdünnermedien mit jeweils 100 μM, 500 μM oder 1000 μM des Stoffes gegenüber einer zusatzfreien Kontrolle auf ihre kryoprotektive Funktion hin getestet. Die Supplementation mit Zinksulfat-Heptahydrat beeinflusste die Spermaqualität nach dem Auftauen nicht.

Schlussfolgernd ermöglichen die dargestellten Modifikationen im Verarbeitungsprozess der Kryokonservierung eine Qualitätssteigerung von tiefgefrierkonserviertem Versandsperma beim Eber. Eine zügige Weiterverarbeitung 2 Stunden nach Ankunft der Proben ist einer zusätzlichen Haltezeit von 24 Stunden bei 17 °C vorzuziehen. Die Äquilibrierungsdauer bei 5 °C sollte auf insgesamt 4 Stunden verlängert werden. Als Basis für Kühl- und Gefrierverdünner erbringt eine 11 %ige Laktoselösung in Kombination mit Eidotter, Glycerol und Orvus ES Paste die besten kryoprotektiven Eigenschaften. Ein Zusatz von Zinksulfat-Heptahydrat ist verzichtbar.

abstract (englisch)

A fundamental problem for the cryopreservation of boar semen is the high susceptibility of boar spermatozoa to chilling injury. Therefore, the aim of the present study was to increase the tolerance towards cooling and, consequently, to improve the quality of shipped boar semen by modifying processes during cryopreservation.

In total, four modular trials were performed.The results of each completed trial were implemented into the following. Thus, a continuous improvement of the procedure could be reached. All ejaculates were collected at the same boar stud. They were diluted 1+1 (v/v) with Beltsville thawing solution and shipped overnight to the research laboratory for further processing. Upon arrival, quality control of the prediluted ejaculates, cryopreservation using split sample technique and quality control after thawing were carried out.

Quality control was done by microscopy as well as with a computer-assisted sperm analysis system (AndroVision®, Minitüb, Germany) and by flow cytometry (Accuri C6, BD Biosciences, Belgium). Microscopic assessment included evaluation of sperm morphology after arrival at the laboratory and evaluation of acrosome integrity post-thaw. Motility analysis was done after 10 minutes of incubation at 38 °C. Additionally, thawed semen was examined after incubation for 30 and 120 minutes at the same temperature. Flow cytometric assessment of chromatin stability, mitochondria activity (rhodamine 123) and plasma membrane and acrosome integrity (FITC-PNA, FITC-PSA) gave further information on sperm quality.

In the first trial, the effect of an additional holding time at 17 °C after 20 hours of shipment was studied. The influence of holding times of 2 hours (which is the time needed for first quality control after arrival) and 24 hours on post-thaw quality was compared. Using 2 hours of holding time revealed a significant better preservation of motility and beat cross frequency post-thaw.

The second trial was done to evaluate the cryoprotective effect of trehalose and Androstar® CryoPlus (Minitüb, Germany) in comparison to a commonly used 11 % lactose solution. Androstar® CryoPlus was prepared according to manufacturer’s specifications. Trehalose was used as 300 mM solution. The use of Androstar® CryoPlus gave a significant lower sperm quality than media composed of trehalose and lactose. Resulting in post-thaw motilities of above 40 %, trehalose and lactose had good cryoprotective effects. The proportion of membrane and acrosome intact spermatozoa tended to be higher using lactose than trehalose.

In the third trial, the effect of short and long-term equilibration in cooling extender at 5 °C was studied. Among other parameters, post-thaw motility after 4 hours of equilibration proved to be superior to that after 2, 24 and 48 hours.

The last trial was performed to check the cryoprotective effect of zinc sulphate heptahydrate on boar spermatozoa. The substance was added to cooling, freezing and thawing extenders in amounts of 100 μM, 500 μM or 1000 μM and compared to a control group without zinc supplement. Sperm quality post-thaw was not influenced by the addition of zinc sulphate heptahydrate.

In conclusion, the presented modifications in cryopreservation of shipped boar semen allow an increase in sperm quality post-thaw. Semen processing within 2 hours after arrival of prediluted samples at the laboratory is preferred to 24 hours. The current equilibration period at 5 °C should be extended from 2 to 4 hours. Best cryoprotective properties are yielded using 11% lactose-based cooling and freezing extender with egg yolk, glycerol and Orvus ES Paste. Supplementing zinc sulphate heptahydrate does not improve semen quality and therefore is not recommended.

keywords

Ebersperma, Tiefgefrierkonservierung, Verdünner, boar semen, cryopreservation, extender

kb

2.703