Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Anne-Kathrin Sauer

 

Analysis of the sialic acid binding activity of the hemagglutinins of influenza viruses and its role in host tropism

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103463

title (ger.)

Analyse der Sialinsäure-Bindungsaktivität der Hämagglutinine von Influenzaviren und deren Bedeutung für den Wirtstropismus

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/sauera_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Influenza A Viren gehören der Familie Orthomyxoviridae an. Ihr einzelsträngiges RNAGenom ist segmentiert und weist eine negative Orientierung auf. Das virale Glykoprotein Hämagglutinin (HA) ist verantwortlich für Rezeptorbindung und für die Fusion der viralen mit der zellulären Membran. Die Rezeptordeterminanten für Influenzaviren sind Sialinsäuren, die eine terminale Position in Zuckerketten von Glykolipiden und Glykoproteinen einnehmen. Verschiedene Influenzavirus-Stämme (z.B. aviären und human Ursprungs) besitzen unterschiedliche Affinitäten zu Sialinsäuren, die in α2,3 oder α2,6 Konformation mit einer Galactose verbunden sind. Um diese beiden Rezeptor-Determinanten zu unterscheiden werden in vielen Studien die Pflanzenlektine MAA (von Maackia amurensis) und SNA (von Sambucus nigra) verwendet. Da aber einerseits eine große Vielfalt an Zuckerstrukturen existieren und andererseits eine Reihe unterschiedlicher HA-Subtypen beschrieben wurden, wird die Nutzung von nur zwei Pflanzenlektinen dieser Diversität nicht gerecht und kann die natürlichen Zusammenhänge nur unzureichend wiedergeben.

Daher wurden in dieser Arbeit lösliche Hämagglutinine (engl. soluble hemagglutinins, solHAs) erzeugt, deren eigene Sialinsäure-bindende Eigenschaften genutzt wurden um die Bindung an Sialoglykokonjugate zu untersuchen, die Interaktionspartner für Influenzaviren darstellen. Die Verknüpfung der HA Ektodomäne mit der konstanten Region einens humanen IgG-Moleküls (-Fc) oder an eine modifizierte GCN4 Leucinzipper Sequenz, die als Trimerisierungsdomäne diente führte zu löslichen Proteinen, die über ihren jeweiliges Anhängsel (engl. tag) einfach zu reinigen und nachzuweisen waren.

SolHAs von verschiedenen Subtypen aviären, humanen und porzinen Ursprungs und sogar eines aus einem neu entdeckten Fledermaus Influenzavirus wurden in dieser Arbeit in Bezug auf ihre Bindung an Zellen und Gewebe untersucht. Die Ergebnisse wurden verglichen mit Bildern, die durch Bindungsversuche mit Pflanzenlektinen erhalten wurden. Die Bindung der solHAs an Zellen war reduziert, wenn die Sialinsäuren durch vorherige Neuraminidase-Bahndlung von der Zelloberfläche entfernt wurden. Das Bindungsmuster der löslichen H7Fc und H9Fc Proteine entsprach dem, das mit intakten Viruspartikeln der betreffenden Subtypen erhalten wurden. Obwohl die meisten in dieser Arbeit untersuchten Zelllinien Sialinsäure in beiden Verknüpfungstypen exprimierten unterschied sich die Bindung der verschiedenen HA-Subtypen teils stark. Um die Rezeptorverteilung in primären Gewebe zu untersuchen, wurden Bindungstests mit Cryoschnitten von Trachea aus Huhn, Pute und Schwein und Lungenschnitten vom Schwein durchgeführt. Auch hierbei wurde deutlich, dass die verschiedenen HAs eine unterschiedliche Bindungseffizienz aufwiesen, die durch Lektinfärbung nicht vorherzusagen war. Die Affinität zu verschiedenen Sialoglykanen wurde weiterhin mittels der Glycan Array Technologie untersucht. Diese Daten zeigen deutlich, dass die Pflanzenlektine und die HAs unterschiedliche Glykokonjugate erkennen.

Die in dieser Arbeit dargestellten Daten zeigen, dass Lektine kein optimales Hilfsmittel sind, um die komplexen Zusammenhänge der Rezeptorbindung und Rezeptorverteilung bei Influenzaviren zu untersuchen. Durch die Benutzung von löslichen HAs konnten wir sogar kleinere Unterschiede in der Rezeptorbindung verschiedener HA Subytpen aufzeigen. Mit diesem Ansatz könnte es in Zukunft sogar mögliche sein, definierte Glykoprotein- oder Glykolipid-Rezeptoren für Influenzaviren zu identifizieren.

 

abstract (englisch)

Influenza A viruses belong to the family Orthomyxoviridae. They are single-stranded RNA viruses with a segmented genome of negative orientation. The influenza hemagglutinin (HA) is the viral envelope glycoprotein responsible for binding of the virion to the host cell and fusion of the viral with the cellular membrane. It is synthesized as an uncleaved precursor and introduced into the host cell secretory pathway where it is posttranslationally modified and forms trimers. The receptor determinants for influenza A viruses are sialic acids, terminal sugars of glycan chains present on glycolipids or glycoproteins. Different virus strains (e.g. avian and human strains) have different affinities for either _2,3- or _2,6-linked sialic acids. To distinguish between these two types of receptor determinants, the plant lectins MAA (from Maackia amurensis) and SNA (from Sambucus nigra) were used in many studies. Due to the huge diversity of oligosaccharide structures on the one hand and the different hemagglutinin subtypes on the other hand, those two plant lectins are not sufficient to characterize the binding properties of influenza hemagglutinins. Therefore, soluble hemagglutinins (solHAs) were generated that can be used as lectins for detection of those sialoglycoconjugates that are interaction partners for influenza viruses. Fusion of the ectodomain to the Fc-component of a human IgG and to a modified GCN4 leucin zipper motif as trimerization domain leads to chimeric proteins that are secreted into cell culture supernatant after transfection of HEK293T cells. These soluble hemagglutinins of different avian, human and porcine viruses as well as that of newly discovered bat influenza virus were analyzed for the binding to cells and tissue sections by confocal laser scanning microscopy and the results were compared with pictures obtained by staining with plant lectins. Binding of solHAs was reduced when sialic acids were released from the cell surface by prior neuraminidase pretreatment of cells. The binding patterns obtained with H7Fc and H9Fc was comparable to those observed with the respective intact virions, i.e.H7N7 and an H9N2 strain. SolHAs of different subtypes bound with different efficiencies to continuous cell lines from different species. Although most cell lines expressed both sialic acid linkage types in similar intensities, the binding of HA subtypes differed. To investigate the binding to the respiratory epithelium of potential hosts, binding tests were perfomed with tracheal sections from chicken, turkey and swine as well as with sections from the pig lung. Again, this assay showed different efficiency of the different HA subtypes that were not predictable by lectin staining. The affinity to sialoglycans was further analysed by applying the glycan array technology. This showed a clear difference between the glycoconjugates detected by the two plant lectins and by solHAs. These data showed that plant lectins are not the optimal tool to investigate the complex issue of receptor binding of influenza viruses. Using solHAs we have been able to detect even small differences in receptor specificity and to show an approach that finally may even allow the identification of specific glycoprotein or glycolipid receptors for influenza viruses.

 

keywords

Influenza Hämagglutinin, Sialinsäure, Bindung; influenza hemagglutinin, sialic acids, binding

kb

40.912