Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Susanne Sasse

Untersuchungen zur neuronalen Protektion nach Einsatz lentiviral modifizierter Fibroblasten auf Cochlea-Implantat-Oberflächen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105931

title (engl.)

Investigations of neural protection on cochlea implant surfaces using lentivirally modified cells

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/sasses_ws14.pdf

abstract (deutsch)

In früheren Studien wurde der protektive Effekt von neurotrophen Faktoren wie dem Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) auf das Überleben von Spiralganglienzellen (SGZ) belegt. Hierzu konnte ein protektiver Effekt durch BDNF-produzierende Zellen auf SGZ gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit ist es, die Anwendbarkeit dieses Ansatzes für modifizierte Cochlea-Implantat (CI) Oberflächen zu zeigen, um eine Steigerung der Effizienz des CI zu erreichen und somit die Hörqualität von betroffenen Patienten maßgeblich zu verbessern. Dazu wurden in der vorliegenden Studie als Modellelektroden dienende Silikonelastomere mit lentiviral modifizierten, BDNF-produzierenden Fibroblasten (NIH3T3) besiedelt. Dieses Modell wurde im Hinblick auf den Einsatz als zellbasiertes Drug-Delivery-System im Innenohr getestet.

In der vorliegenden Arbeit wurden dazu folgenden Schwerpunkte festgelegt:

1.        Etablierung eines In-vitro-Modells mit lentiviral modifizierten NIH3T3-Zellen adherierend auf der Oberfläche von Silikonelastomeren. Diese biofunktionalisierten Modellelektroden wurden auf drei wichtige Parameter untersucht:

a.         Bestimmung der Proliferationsfähigkeit der adherierenden Zellen. Anhand von Zellkultur und anschließendem Auszählen der Zellen auf den Elektronenträgern sowie Durchlicht-und Fluoreszenzmikroskopie wurde die Proliferarationsfähigkeit der NIH3T3/BDNF-Zellen nach 4, 7 und 14 Tagen ermittelt.

b.         Quantifizierung der Freisetzung des Wachstumsfaktors BDNF in das umliegende Medium. Hierzu wurde anhand von Quantifizierung der Konzentrationen in den gesammelten Überständen mit Hilfe von ELISA die Freisetzung von BDNF aus zellbesiedelten Modellelektroden bestimmt

c.         Nachweis der Bioaktivität des Konstrukts auf Spiralganglienzellexplantate. Die mit NIH3T3/BDNF-Zellen besiedelten Modellelektroden wurden in Ko-Kultivierung mit Spiralganglienzellen von neonatalen Ratten gegeben und für 7 Tage kultiviert. Darauf folgten immuncytochemische Untersuchungen von Überlebensraten und Neuritenwachstum der Spiralganglienzellen.

Ein signifikanter Anstieg der Proliferationsrate konnte ab Tag 7 (40.371 ± 3.521 Zellen) ermittelt werden. In Korrelation dazu stieg die BDNF-Produktion zwischen Tag 4 (0,4 ± 0,05 ng/ml), 7 (4,7 ± 0,55 ng/ml) und 14 (9,1 ± 1,64 ng/ml) an. Die SGZ zeigten eine signifikant hohe Überlebensrate sowie gesteigertes Neuritenwachstum in Ko-Kultivierung mit den biofunktionalisierten Modellelektroden.

2.        Nach erfolgreichem Abschluss der In-vitro-Versuche wurden die biofunktionalisierten Modellelektroden im In-vivo-Experiment in die Innenohren von systemisch ertaubten Meerschweinchen implantiert und dort hinsichtlich ihres Effektes auf Spiralganglienzellen untersucht. Die Tiere wurden 21 Tage nach der Implantation getötet, die Modellelektroden entfernt und die Cochleae hinsichtlich der SGZ-Dichte histotologisch untersucht. Eine signifikant erhöhte SGZ-Dichte auf der implantierten Seite (6,16 ± 0,43 SGZ/10.000 µm2, p < 0,001) im Vergleich zur kontralateralen, unbehandelten Seite (4,33 ± 0,34) sowie im Vergleich zu den Tieren implantiert mit Kontrollmodellelektroden (1,05 ± 0,28) wurde ermittelt.

Die Ergebnisse lassen die Schlußfolgerung zu, dass immobilisierte, genetisch modifizierte Zellen auf Modellelektroden, als BDNF-Lieferant für ein gesteigertes Spiralganglienzellüberleben ein geeignetes Drug-Delivery-System für das Innenohr darstellen.

abstract (englisch)

Many studies have shown the protective effect on spiral ganglion neurons (SGN) by neurotrophic factors as the brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Also it was possible to proof the biological effectiveness of BDNF-producing fibroblasts on the activity of SGN. The aim of this study was to proof the capability of this approach regarding cell-modified cochlea implant surfaces in order to improve the performance of the CI and to enhance hearing quality of patients decisively. Therefore silicone elastomeres were seeded with lentival-modified, BDNF-producing fibroblasts (NIH3T3). This model of a biofunctionalized electrode was studied in accordance to be used as a cell-based drug-delivery system in the inner ear.

In this study we focused on the following aspects:

1.        Establishing an in vitro-model using lentivirally modified NIH3T3 cells attached to the surface of silicone elastomeres and investigation of three main parameters:

a.         Capability of proliferation of adherent cells. Using cell culture techniques and counting of cells adherent on the surface of the elastomeres followed by fluorescence microscopy, it was possible to determine the proliferation of NIH3T3/BDNF cells following 4, 7 and 14 days.

b.         Quantification of BDNF release. Using ELISA the concentration of BDNF expression of cells adherend on the elastomeres were quantified in order to reveal the releasing rate.

c.         Bioactivity of model on spiralganglion neuron explants. Silicone elastomeres covered with NIH3T3/BDNF-cells were co-cultured with spiral ganglion neurons of neonatal rats for 7 days, followed by immunohistochemical investigations of survival rates und neurite outgrowth.

A significant increase in proliferation was revealed up from day 7 (40,371 ±3,529 cells). BDNF-production increased up from day 4 (0.4 ±0.05 ng/ml), 7 (4.7 ±0.55ng/ml) and day 14 (9.1 ±1.64 ng/ml). Spiralganglion neurons revealed a significantly higher survival rate as well as an increased neurite outgrowth when co-cultured with biofunctionalized model electrodes.

2.        To investigate a potential neuroprotective effect of such modified model electrodes in vivo the cell-coated model electrodes were then implanted into the left ears of systemically deafened guinea pigs. Animals were sacrificed 21 days after implantation, electrodes were explanted and cochleae were histologically evaluated for SGN density. A significant increase in SGN density in the implanted side (6.16 ±0.43, SGC/10,000 µm2 p< 0.001; mean values ± standard error of mean) compared to the contralateral untreated side (4.33 ±0.34) and animals implanted with control model electrodes (1.05 ±0.28) was observed

The results lead to the conclusion that immobilized, genitically modified cells covering model electrodes, to release BDNF for an increased SGN survival after deafness seem to be a promising drug delivery system to the inner ear.

keywords

Cochlea-Implantat, Drug-Delivery-System, Innenohr, cochlea implant, drug delivery, inner ear 

kb

3.457