Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Stephanie Sander, geb. Thebille

Luminometrische Verlaufskontrolle des ATP-Gehaltes von flowzytometrisch geschlechtsdifferenzierten bovinen Spermien

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108479

title (engl.)

Luminometric study of the ATP-content in flow cytometrically sorted bovine sperm

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/sanders_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Die momentan einzige Möglichkeit, Spermien mit einer hohen Exaktheit nach ihren geschlechtsbestimmenden Eigenschaften zu sortieren, ist die Beltsville Sperm Sexing Technology® mittels Flowzytometrie. Obwohl diese Technik zuverlässig ist und in der Rinderzucht mittlerweile kommerziell genutzt wird, variiert die Qualität des gesexten Spermas nicht nur zwischen verschiedenen Bullen, sondern auch zwischen unterschiedlichen Ejakulaten. In dieser Arbeit wurde der Energiehaushalt der Spermien mittels eines ATP-Lumineszenz-Testes untersucht, um Stressfaktoren während des Sortierprozesses auf die Mitochondrien nachzuweisen. Dazu wurden verschiedene Schritte des Sortingprozesses, im Besonderen der Effekt durch den Hoechst 33342 Farbstoff, die elektrische Spannung, die elektrostatische Ablenkung und die Laserexposition im Vergleich zwischen unsortiertem und sortiertem Sperma untersucht.

Ergebnisse: Die geschlechtsspezifische Sortierung von Spermien im Flowzytometer hat einen signifikanten negativen Einfluss auf ihren ATP-Gehalt, obwohl die Motilität nach dem Sortieren zunächst erhöht ist, was auf die Hyperaktivierung durch die beginnende Kapazitation und die Selektion von membranintakten Spermien zurück zu führen ist. Ein positiver Effekt auf den ATP-Gehalt der Spermien und ihre Motilität wurde durch den Einsatz des Sexcess® Verdünners erzielt. Weder die Anfärbung mit Hoechst 33342 noch die Minimierung der mechanischen Kräfte des Piezokristalls auf den Flüssigkeitsstrom der Spermien bewirkte signifikante Veränderungen in Bezug auf den Energiegehalt. Die Deaktivierung der elektrostatischen Ablenkung führte zu einer geringeren ATP-Produktion, welches der fehlenden Hyperaktivierung zuzuschreiben ist. Der ATP-Gehalt und die Gesamtmotilität der Versuchsgruppe, die ohne Laser den Sorter passiert hatte, waren signifikant geringer im Vergleich zur standardsortierten Gruppe. Ohne den Laser konnte ein aussortieren der membrandefekten Spermien nicht stattfinden, was zu einem insgesamt geringeren ATP-Gehalt dieser Versuchsgruppe führte.

Zusammenfassend ergibt sich, dass die Bestimmung des ATP-Gehaltes die Motilitätsdiagnose mittels CASA-System ergänzen kann und eine frühe Aussage zum Energiehaushalt der eingesetzten Spermien zulässt. 

abstract (englisch)

So far, only Beltsville Sperm Sexing Technology® based on flow cytometry is able to separate X- and Y- chromosome bearing sperm with high accuracy. Although the technique is reliable and has been introduced into bovine breeding strategies, qualities of sorted sperm vary not only among bulls but also among ejaculates. As standard sperm quality assessments do not allow a secure prediction of whether sorted sperm are fully fertile, it is necessary to include further sensitive methods to predict fertility. Therefore, the energy balance was tested by a recently developed luminescence ATP test to identify stress factors on sperm mitochondria during different steps of flow cytometrical sorting. Especially, effects of Hoechst 33342 dye, piezo crystal forces, electrostatic deflection, and laser exposure were studied and compared to non-sorted and standard sorted sperm.

Results: The sorting process has a significant negative impact on the ATP content of sorted sperm. However motility was increased significantly after sorting mainly due to hyperactivation caused by capacitation and presumably by selection of membrane intact and viable sperm during the sorting process. A positive effect on ATP content and motility was also seen, when sperm were processed in Sexcess® catch fluid and diluter. The use of Hoechst 33342 as well as minimzed forces caused by the piezo crystal movements did not show any significant effect on the energy release and sperm motility. The deactivation of the electrical deflection kept ATP production on a low level, presumably due to absence of hyper activation. All over ATP production and degree of motility in sperm passing the sorter with deactivated laser was significantly lower as compared to the normal sorted group. With a deactivated laser not only sex related sorting is impossible, separation of membrane defect sperm will not take place and reduce the mean ATP content of the total sperm group.

In conclusion, the measurement of ATP content supplements the motility diagnostic of CASA-systems and provides an early judgement of the energy balance and the lifespan of sex sorted bovine sperm. 

keywords

ATP, Spermien, geschlechtsdifferenziert, ATP, sperm, sorted 

kb

1.503