Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 

 Mohamed Samir Ahmed Mohamed

 

 MicroRNAs as biomarkers in the host response to influenza A virus infection in humans and animals

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108460

title (ger.)

MicroRNAs als Biomarker der Wirtszellantwort auf Influenza A Infektion in Menschen und Tieren

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/samirahmedmohamedm_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Influenza A Viren (IAV) gehören zu der Familie der Orthomyxoviridae. Als Genom besitzen sie einzelsträngige RNA mit negativer Polarität. IAVs waren die Auslöser für drei große Pandemien im letzten Jahrhundert: 1918 A/H1N1; 1957 A/H2N2; und 1968 A/H3N2. Der Erreger einer vierten Pandemie 2009 war ein H1N1 Virus mit einem dreifachen Reassortment. Der Subtyp H5N1 beinhaltet das hoch pathogene aviäre Influenza Virus (HPAI), welches eine hohe Letalität in Vögeln aufweist, aber auch andere Spezies, einschließlich den Menschen, infizieren kann. MicroRNAs (miRNAs) sind kurze, nichtkodierende RNAs (small noncoding RNAs, sncRNAs) und spielen eine wichtige Rolle in der Feinregulierung der Genexpression. Unter pathologischen Bedingungen verändert sich die Expression der miRNAs und bietet dadurch einen vielversprechenden Ansatzpunkt in ihrem Gebrauch als Biomarker zur Bestimmung von Krankheiten und ihrem Verlauf. Ein besonderes Augenmerk richtet sich dabei auf IAV Ausbrüche in der Nutzierhaltung, wo diese kleinen Moleküle erste Krankheitsfälle aufspüren und eine weitere Ausbreitung verhindern könnten.

Meine Doktorarbeit zielte darauf ab, die Bedeutung der miRNAs in der Wirtszellantwort auf IAV in Menschen und Tieren zu untersuchen und bestimmte miRNAs zu identifizieren, die als potentielle Biomarker nützen könnten.

Vor den ersten Experimenten habe ich eine ausgiebige Literatursuche gemacht, um einen Überblick über die aktuell bekannte Rolle der Wirts-miRNAs in viralen Infektionskrankheiten, die für die Veterinärmedizin bedeutend sind, zu bekommen. Ein weiteres Ziel der Literaturrecherche war, Perspektiven und Hindernisse in dem Gebrauch von sncRNAs, insbesondere miRNAs, zur Kontrolle und Prävention von viralen Krankheitsausbrüchen mit Auswirkungen auf die Nutztierhaltung zu identifizieren. Diese Recherchen ergaben zwei Übersichtsartikel (Manuscript I und Manuscript II).

In dem ersten Teil der experimentellen Arbeit (Abschnitt 4.1 in Unpublished data) habe ich mittels Reverse Transkriptase Echtzeit-PCR (RT-qPCR) die durch Sequenzierungstechnologie der Nächsten Generation (next generation sequencing, NGS) gewonnenen Daten überprüft, und zwar in Bezug auf die relativen Expressionsspiegel eines ausgesuchten Sets von miRNAs. Diese ausgewählten miRNAs wurden zuvor von Dr. Matthias Preuße (Helmholtz Zentrum für Infektionskrankheiten)  im Zusammenhang mit einer Krankheitsempfänglichkeit gegenüber PR8 H1N1 in Mäusen identifiziert. Das Ergebnis war eine hohe Übereinstimmung der beiden Herangehensweisen, was dafür spricht, dass RT-qPCR eine geeignete Methode ist, um NGS-Ergebnisse zu bestätigen.

In dem zweiten Teil der Doktorarbeit (Manuscript III), habe ich in vitro Assays mit humanen Zelllinien etabliert, um die Zellart-spezifische Expression von miRNAs nach Stimulierung mit Agonisten von Toll-ähnlichen Rezeptoren (toll like receptors, TLR) oder nach Infektion mit Influenzaviren zu untersuchen. Infiziert wurden die Zellen mit zwei verschiedenen Influenzaviren, einem Wildtyp der Pandemie 2009 (swine-origin influenza virus, S-OIV wt) und einer reassortierten Variante (S-OIV NS PR8), der das NS Segment des PR8 H1N1 Virus trägt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass S-OIV NS PR8 eine Zellart-abhängige Veränderung bestimmter miRNAs hervorruft (miR-223 und miR-155), verglichen mit dem S-OIV wt. Die Infektion mit beiden Influenzatypen führte zu einer höheren Expression der miRNAs in humanen Lungenepithelzellen (A549) verglichen mit Makrophagen ähnlichen Zellen (dTHP-1). Die Stimulation mit TLR Agonisten (LPS and R848) ergab ein umgekehrtes Bild.

Der dritte Teil meiner Doktorarbeit (Manuscript IV und Manuscript V) zielte darauf hin, die miRNA-Antwort auf Infektion mit dem Virus HPAI H5N1 in einem natürlichen Wirt zu untersuchen. Dafür wurde eine native Entenrasse (Anas platyrhynchos) mit A/chicken/Faquos/amn12/2011 (H5N1) Virus infiziert, einem ägyptischen Isolat, das nach einer phylogenetischen Analyse der Klade 2.2.1.2. zugehörig ist. Die erste virologische Untersuchung ergab niedrigere virale Transkription, Wachstumsrate und Pathologische Veränderungen im Gehirn verglichen mit anderen Organen, insbesondere der Lunge. Da diese Ergebnisse darauf deuteten, dass es eine organspezifische Wirtsantwort auf HPAI H5N1 Infektion gibt, wurde nun NGS (small RNA sequencing, small RNA-seq) eingesetzt, um die Hypothese zu testen, dass in diesen Organen spezifische miRNA-Antworten nachzuweisen sind. Als Ergebnis dieser Untersuchung war zu sehen, dass in den Lungen die miRNA Umprogrammierung insgesamt stärker ausfiel und früher stattfand, als im Gehirn. Der Maximalwert der miRNA-Antwort wurde in beiden Organen im späten Infektionsstadium (72-120 hpi) erreicht, nach dem Höchstwert der viralen Transkription. Daraus lässt sich schließen, dass die miRNA-Umprogrammierung einen Teil der Wirtsantwort im Gewebe auf die virale Transkription, die Replikation, darstellt.

Des Weiteren wurden allgemeine und organspezifische miRNAs identifiziert, die eine charakteristische Gruppen bildeten, unter anderen miR-183, miR-194, miR-205 und miR-215. Gene, die für die Differenzierung von T-Helferzellen und die Regulation von JUN-Kinase Aktivität verantwortlich sind, waren in beiden Organen hochreguliert. Obwohl einige Signalwege, wie MAPK und Jak-STAT, in beiden Organen aktiviert wurden, war die Aktivierung in der Lunge höher als im Gehirn. Insgesamt  ergibt sich der Hinweis auf eine Beteiligung der miRNAs in der Organ-spezifischen Antwort auf HPA H5N1 und auf eine regulatorische Funktion der viralen Replikation in verschiedenen Geweben der Ente. Des Weiteren weist diese Studie auf die Möglichkeit des zukünftigen Gebrauchs von miRNA als potentielle Biomarker bei der IAV Infektion hin.

Im letzten Teil meiner Doktorarbeit (Abschnitt 4.2 in Unpublished data), etablierte ich ein humanes Lungenexplantat-Modell (human lung tissue explant, HLTE), um den Effekt des reassortierten NS Segments auf die virale Replikation und die Wirtsexpression von miRNAs in einem humanen Geweben ex vivo zu untersuchen. Dieses Modell ermöglicht eine Annäherung der gegenwärtigen Infektionsmodelle an die Infektion beim Menschen. Hierfür verwendete ich die beiden in Manuscript III beschriebenen Viren (S-OIV wt und S-OIV NS PR8). Die erste Etablierung des HLTE Modells führte zu einer Replikation von beiden Viren. Die NS Reassortierung  führte zu einer Erhöhung der viralen Transkription, besonders nach 8 und 48 hpi. Dies wurde begleitet von einer Steigerung der IFN-α mRNA- und Protein-Expression. Ein weiteres Ergebnis waren verstärkte Endothelzellschäden und Epithelzellablösungen durch S-OIV NS PR8, verglichen mit dem S-OIV wt.

Zusammengefasst lassen meine Ergebnisse darauf schließen, dass miRNAs eine Schlüsselrolle in der Wirtsantwort auf unterschiedliche IAV Typen spielen. Sie weisen zellart- und organspezifische Expression und Funktionen auf. Die Untersuchung der miRNA-Antwort auf HPAI H5N1 in einem natürlichen Wirt, d.h. der Ente, ist hilfreich, um Schlüsselprozesse von Krankheitsempfänglichkeit und Übertragbarkeit auf Menschen zu identifizieren. Des Weiteren weisen die Ergebnisse auf die vielversprechende Rolle der miRNAs als wirtsbezogene Biomarker bei IAV Infektionen hin.

 

 

abstract (englisch)

Influenza A virus (IAV) is a negative sense, single-stranded RNA virus that belongs to the family of Orthomyxoviridae. In addition to the seasonal epidemics, it caused three human pandemics in the last century (1918 A/H1N1, 1957 A/H2N2, and 1968 A/H3N2). In 2009, the world was confronted with the fourth pandemic caused by a triple reassortant H1N1 virus. The highly pathogenic avian influenza (HPAI) viruses of the subtype H5N1 are unique in that they are highly lethal to birds and are able to cross the species barrier and infect humans. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs (sncRNAs) that are able to fine-tune gene expression. The modulation of miRNAs under pathological conditions raises the possibilities of utilizing them as host biomarkers to pinpoint the disease in question and track its progress. This applies similarly to IAV at the farm level, where these small molecules might aid sensing the very early cases before the outbreaks spread widely. 

The objectives of my thesis were to investigate the importance of miRNAs as components of the host response to IAVs in humans and animals and to identify candidate miRNAs that might be used as future biomarkers.

Before starting the experiments, I performed a literature search with the aim to review the up-to-date known roles of host-encoded miRNAs in infectious viral diseases of veterinary importance and the potential of using small non-coding RNAs to limit and/or prevent infectious viral diseases in livestock of veterinary importance. This resulted in two review articles (Manuscript I and II).

In the first part of the experimental work (section 4.1 in Unpublished Data), I used reverse transcriptase real-time PCR (RT-qPCR) to validate the results of next generation sequencing (NGS; specifically, small RNA sequencing, small RNA-seq) with regard to the relative expression levels of a set of miRNAs. Those miRNAs have been previously identified by Dr. Matthias Preuße (Helmholtz Center for Infection Research) to be associated with susceptibility to PR8 H1N1 in murine system. As a result, both approaches agreed to a high degree, indicating that RT-qPCR is a valid method to confirm the results of RNA-seq. 

In the second part (Manuscript III), I established in vitro assays comprising human cell lines to study the cell type-specific expression of miRNAs following stimulation with toll-like receptor (TLR) agonists and after infection with 2009 swine-origin influenza virus wild type (S-OIV wt) and S-OIV NS PR8, a reassortant variant of it that carries the NS segment of the PR8 H1N1 virus. The findings indicated that S-OIV NS PR8 triggered a cell-dependent alteration of certain miRNA (e.g. miR-223 and miR-155) as compared to the S-OIV wt. The data also show that while the infection with both viruses caused higher expression of miRNAs in human lung epithelial (A549) than in macrophage-like (dTHP-1) cell lines, the TLR agonists (LPS and R848) displayed the reverse pattern.

In the third part of my thesis (Manuscripts IV and V), I aimed to analyze the miRNA responses to the HPAI virus H5N1 in a natural host. Therefore, a native duck breed (derived from Anas platyrhynchos) was experimentally infected with A/chicken/Faquos/amn12/2011(H5N1) virus, an Egyptian isolate that, according to my phylogenetic analyses, belongs to the recently emerging clade 2.2.1.2. The initial viral characterization revealed that brain, compared to other organs notably lung, exhibited much lower viral transcription, growth rate and associated tissue-pathology. As these results suggested an organ-specific host response to HPAI H5N1 virus infection, small RNA-seq. was employed to test the hypothesis if there is a unique miRNA response in these organs. As a result, the overall degree of miRNA reprogramming was higher and manifested earlier in lung than in brain. In both organs, the magnitude of the miRNA response reached the peak during the late infection stage (72-120 hpi), following the peak of viral transcription, arguing that the miRNA reprogramming is part of the host tissue response to viral transcription and, consequently, replication. I also identified common and organ-specific miRNAs that have a characteristic clustering pattern, including miR-183, miR-194, miR-205 and miR-215. Generally, gene ontologies such as T-helper cell differentiation and Positive regulation of JUN kinase activity were commonly enriched in both organs. Although certain pathways were enriched in both organs such as MAPK and Jak-STAT signaling pathways, their enrichment degree was higher in lung than in brain. Considered together, these results propose the involvement of miRNAs in the organ-specific response to HPAI H5N1 and that their regulatory roles might shape the replication of the virus in different duck tissues. Furthermore, this study suggests possibilities for the future use of miRNAs as candidate biomarkers in IAV infection.

In the last part of my thesis (section 4.2 in Unpublished Data), I established a human lung tissue explant (HLTE) model to study the impact of single reassortment of IAV NS segment on viral replication and differential host miRNA expression in a human tissue ex vivo. This approach might narrow the gap between current infection models and the actual human infection. For this purpose, I used the two viruses that I mentioned in Manuscript III (S-OIV wt and the S-OIV NS PR8). The initial establishment indicated that the HLTE model could support the replication of both viruses. However, the NS reassortment augmented viral transcription, especially at 8 and 48 hpi. This was associated with increased IFN-α mRNA and protein levels. It was also found that S-OIV NS PR8 caused a consistent higher degree of endothelial damage and epithelial delamination when compared to the S-OIV wt.

In summary, my results suggest that miRNAs are key players in the host response to various IAV strains. They exhibit cell type- and organ-specific expression and possibly function. Studying the miRNA response to HPAI H5N1 in ducks, a natural host, will help to identify key processes in disease susceptibility and, possibly, transmission to humans and further underscoring the potential value of miRNAs as host biomarkers in IAV infection.


 

 

keywords

miRNAs, influenza virus, duck, MiRNAs, Influenza, Ente

kb

7.008