Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Britta Ruhmann

 

 Untersuchungen zur Interferon-τ Wirkung auf die Leber in der Frühgravidität bei Rindern

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109432

title (engl.)

Influence of Interferon-τ on the liver in early pregnant heifers

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/ruhmanb_ws16.pdf

abstract (deutsch)

Das Trächtigkeitssignal IFNτ des Wiederkäuers ist essentiell für den Erhalt der Gravidität in ihrem frühen Stadium (Bazer, 2013). Dieses Signal wird von den Trophektodermzellen der wachsenden Blastozyste produziert, wirkt lokal am Endometrium und bewirkt dort unter anderem über die Herunterregulation der Oxytozinrezeptoren die Blockade der Luteolyse (Flint, 1995; Hansen et al., 2013). IFNτ führt an der Zelle zur Induktion einer Gruppe von Genen, die als Interferon-stimulierte-Gene (ISGs) zusammengefasst werden. Diese ISGs sind nicht nur im Endometrium von frühtragenden Tieren nachweisbar (Forde et al., 2011), sondern z. B. auch in Lutealzellen und Leukozyten (Oliveira et al., 2008; Green et al., 2010). Auch in der Leber von Schafen konnte eine erhöhte Genexpression von ISG 15 bei tragenden Tieren und nach Applikation von IFNτ detektiert werden (Chen et al., 2006; Bott et al., 2010; Romero et al., 2015). In einer Vorarbeit konnte bei Rindern der Rasse Holstein Friesian eine erhöhte mRNA-Expression von ISG 15 und MX 1 in Leberbiopsien von an Tag 18 tragenden Färsen im Vergleich zu nichttragenden Färsen bestimmt werden (Meyerholz et al., 2015).

In der vorliegenden Arbeit sollten diese Ergebnisse von Meyerholz et al. (2015) an einer anderen Rinderrasse bestätigt werden. Zudem sollte für diesen Versuch eine Kontrollgruppe eingesetzt werden, die lediglich mit Seminalplasma artifiziell inseminiert wurde. Außerdem sollte neben dem Nachweis von ISG 15 und MX 1 auch die Expression von MX 2 und OAS 1 nachgewiesen und gezeigt werden, ob neben der mRNA auch die Proteine in den Leberbiopsien nachweisbar sind. Des Weiteren war es Ziel, in vitro zu prüfen, ob bovine Hepatozyten, stimuliert durch IFNτ, ISGs exprimieren.

In vivo wurden 13 Färsen der Rasse Angus in eine Versuchs- (n = 9) und eine Kontrollgruppe (n = 4) geteilt. Die Versuchsgruppe wurde mit Sperma und die Kontrollgruppe lediglich mit Seminalplasma artifiziell inseminiert. An Tag 0, 14, 16, 18, 21 und 24 nach der Besamung wurden Blutproben der Tiere entnommen und die Progesteron- sowie Gesamtöstrogenkonzentration bestimmt. An Tag 18 und 21 wurde zudem die optische Dichte der trächtigkeitsassoziierten Glykoproteine gemessen und an Tag 18, 21 und 24 eine Leukozytenisolation aus den Blutproben vorgenommen, um auch in diesen Zellen die mRNA-Expression von ISG 15, MX 1, MX 2 und OAS 1 zu bestimmen. An Tag 18 nach der Besamung wurde bei allen Tieren eine Leberbiopsie entnommen und in dieser die mRNA-Expression von ISG 15, MX 1, MX 2 und OAS 1 mittels quantitativer Real-Time PCR gemessen. Ebenso wurde an diesen Leberbiopsien eine Immunhistologie mit einem Antikörper gegen OAS 1 durchgeführt. Zudem standen histologische Leberbiopsiepräparate von tragenden und nichttragenden Holstein-Friesian Färsen aus dem Versuchen von Meyerholz et al. (2015) zur Verfügung, um an diesen ebenfalls eine Immunhistochemie mit dem Antikörper gegen OAS 1 durchzuführen. In vitro wurde an einer primären, bovinen Hepatozyten-Zellkultur die Wirkung von Progesteron und IFNτ auf die Genexpression von ISG 15, MX 1, MX 2 und OAS 1 untersucht. Hierzu wurden die isolierten Hepatozyten mit IFNτ, Progesteron, beiden Komponenten gemeinsam oder lediglich mit Medium zur Kontrolle inkubiert. Im Folgenden wurde die mRNA der Zellen extrahiert und mit einer quantitativen Real-Time PCR die Expression der Gene ISG 15, MX 1, MX 2 und OAS 1 bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass in den Leberbiopsien von tragenden Färsen der Rasse Angus die Genexpression von ISG 15, MX 1, MX 2 und OAS 1 numerisch und prozentual höher war als bei der nichttragenden Kontrollgruppe. Immunhistologisch konnte an den Leberbiopsien von Färsen der Rasse Angus und der Rasse Holstein Friesian gezeigt werden, dass in der frühen Gravidität Hepatozyten das Protein OAS 1 produzieren. In vitro konnte gezeigt werden, dass die durch IFNτ stimulierten bovinen Hepatozyten die Gene ISG 15, MX 1, MX 2 und OAS 1 signifikant höher exprimieren als die Zellen, die nicht unter IFNτ-Einfluss standen. Progesteron beeinflusste die Expression dieser vier Gene in Hepatozyten nicht.

Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen, dass das Trächtigkeitssignal IFNτ, in vitro und in der frühen Gravidität beim Rind, Hepatozyten dazu stimuliert, ISGs zu exprimieren und zudem, dass das OAS 1-Protein produziert wird. Diese Nachweise bieten somit Ansätze für die weitere Erforschung der physiologischen Wirkung des Trächtigkeitssignals IFNτ als möglichen Einflussfaktor auf die maternale Stoffwechseladaptation beim Rind während der frühen Gravidität.

abstract (englisch)

IFNτ is an essential glycoprotein for the maternal detection and maintenance of early pregnancy in ruminants (Bazer, 2013). This protein is produced by the trophoblastical ectoderm of the growing blastocyst and has a local effect on the endometrium, as IFNτ causes e.g. a decline of receptors for oxytocin, which prevent luteolysis (Flint, 1995; Hansen et al., 2013). Moreover, IFNτ provokes the cell-based expression of “interferon stimulated genes” (ISGs). These ISGs are expressed in the endometrium (Forde et al., 2011a), but an expression was previously also detected in luteal cells or leukocytes (Oliveira et al., 2008; Green et al., 2010). Interestingly, there was a high expression of ISG 15 in the liver of pregnant ewes (Chen et al., 2006; Bott et al., 2010; Romero et al., 2015). In pregnant Holstein Friesian heifers Meyerholz at al. (2015) measured a higher expression of ISG 15 and MX 1 in liver biopsies from day 18 after artificial insemination when compared to nonpregnant heifers.

The experiments of the present study were supposed to confirm the results of Meyerholz et al. (2015) in Angus heifers. A control group, inseminated with seminalplasma was used in order to ensure that no pregnancy is established. The mRNA expression of MX 2 and OAS 1 in addition to the mRNA of ISG 15 and MX should be measured in liver biopsies. Additionally the OAS 1 protein-production should be determined by using an immunohistochemical approach in order to verify whether hepatocytes are reactive of IFNτ. The aim of the in vitro cell-culture-experiment was to proof, whether hepatocytes are able to express ISGs after stimulation with IFNτ.

 Out of thirteen Angus heifers, nine heifers were artificially inseminated with sperm and, as a controlgroup, four heifers were inseminated with seminalplasma. Blood samples were taken on day 0, 14, 16, 18, 21 and 24 after insemination to determine the progesterone and estradiol concentrations. On day 18 and 21 after insemination the pregnancy associated glycoproteins were measured. On these two days and on day 24 after insemination leukocytes were isolated to detect the mRNA expression of ISG 15, MX 1, MX 2 and OAS 1. Liver biopsies were taken on day 18 after insemination. In these samples the relative expression of ISG 15, MX 1, MX 2 and OAS 1 mRNA was analyzed. Furthermore, these liver biopsies were used for the detection of the OAS 1 protein by immunohistochemistry. The in vitro experiment consisted of isolation and cultivation of primary bovine hepatocytes from a slaughtered bull. The primary bovine hepatocytes were cultured in a short term monolayer culture and incubated with IFNτ, progesterone, both, or medium as negative control. After incubation and mRNA isolation the gene expression of ISG 15, MX 1, MX 2 and OAS 1 was measured by using a quantitative real-time PCR.

The present study shows a higher mRNA expression of ISG 15, MX 1, MX 2 and OAS 1 in liver biopsies obtained from pregnant Angus heifers compared to the control group. The immunohistochemical analysis demonstrated the production of the OAS 1 protein in early pregnancy. The results of the in vitro experiment verified the mRNA expression of ISG 15, MX 1, MX 2 and OAS 1 in hepatocytes when stimulated with IFNτ. Progesterone had no influence on the mRNA-expression of these genes in hepatocytes.

In conclusion, the present study showed that ISGs were expressed in liver of cattle in early pregnancy and the production of OAS 1 protein in hepatocytes in vivo. Moreover the ability of IFNτ to stimulate ISG expression in primary bovine hepatocytes is verified. In further experiments the physiological impact of IFNτ on the liver should be further investigated. As hepatocytes react with the gene expression, this could indicate a metabolic adaptive process in early pregnancy or an immunomodulatory effect.

keywords

Hepatozyten, Trächtigkeitserkennung, OAS 1, hepatocytes, maternal recognition of pregnancy, OAS 1

kb

2.507