Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Anna-Theresa Rüdiger

 

Analysis of viral and host factors influencing Alphacoronavirus life cycle in chiropteran and porcine cell lines

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108458

title (ger.)

Analyse viraler und zellulärer Faktoren sowie deren Einfluss auf den Lebenszyklus von Alphacoronaviren in Fledertier- und Schweinezelllinien

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/ruedigera_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Coronaviren (CoV) sind behüllte, einzelsträngige RNA Viren mit positiver Orientierung. Sie besitzen drei bis vier Hüllproteine, das Spike-Protein (S), Membran-Protein (M), Envelope-Protein (E) und einige Vertreter der Betacoronaviren weisen das Hämagglutinin-Esterase-Protein auf. Innerhalb des Viruspartikels befindet sich das Nukleokapsid-Protein, welches mit der RNA assoziiert ist. CoV infizieren Säugetiere, einschließlich des Menschen, sowie Vögel. Es ist bekannt, dass Coronaviren vom Tier auf den Menschen, wie auch zwischen verschiedenen Tierarten übertragen werden können. Seit dem Ausbruch des schweren akuten Atemwegssyndroms (SARS), ausgelöst durch SARS-CoV, stehen insbesondere Fledermäuse im Fokus der Forschung, da sie als Reservoir für SARS-CoV, wie auch für weitere CoV gesehen werden. Das Virus der übertragbaren Gastroenteritis (TGEV), ein Vertreter der Alphacoronaviren, diente in dieser Studie als Modell-Coronavirus. Der Eintritt, die Replikation, sowie das Freisetzen von TGEV wurden in verschiedenen Fledertier-Zelllinien untersucht. Die Oberflächenexpression des spezies-spezifischen Rezeptors, der porzinen Aminopeptidase N, war dabei notwendig um den Eintritt von TGEV in Fledertierzellen zu ermöglichen. Abhängig von der getesteten Fledertierspezies wurden unterschiedliche Rezeptor-Expressionslevel, sowie  Virustiter gemessen. Des Weiteren wurden verschiedene Expressionsmuster für das TGEV S- und M-Protein beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des spezifischen Rezeptors eine wichtige Voraussetzung für den viralen Eintritt darstellt. Die kalkulierten Virustiter aus den Zellkulturüberständen deuten darauf hin, dass weitere Faktoren die Replikation innerhalb der Fledertierzellen beeinflussen. Betrachtet man die unterschiedlichen Verteilungen der TGEV S- und M-Proteine während der Infektion, scheinen Wirtsfaktoren, sowohl abhängig von der Fledermausart als auch vom betroffenen Organ, eine wichtige Rolle für eine erfolgreiche Coronavirusinfektion zu spielen.

Aus diesem Grund wurden zelluläre Faktoren, welche mit dem CoV S-Protein interagieren, näher untersucht. Das S-Protein vermittelt das Anheften an den Wirtszellrezeptor, sowie den Viruseintritt. Für einige Viren konnte bereits gezeigt werden, dass Mikrotubuli für den Transport viraler Komponenten innerhalb der Wirtszelle genutzt werden. In dieser Studie konnte demonstriert werden, dass die letzten 39 Aminosäuren der zytoplasmatischen Domäne des S-Proteins von TGEV und den humanen CoV 229E und NL63 mit Tubulin-alpha- und -beta-Ketten interagieren. Zudem co-lokalisierte das TGEV S-Protein mit β-Tubulinen der Wirtszelle. Eine  induzierte Depolymerisierung der Mikrotubuli führte zu einer Änderung in der TGEV S-Protein Verteilung in infizierten Zellen. Hierbei co-lokalisierten TGEV S-Proteine mit dem ER-Golgi intermediären Kompartment (ERGIC) und mit dem Golgi-Apparat, wobei diese Kompartimente, nach Nocodazole-Behandlung (NOC) verstreut in der Zelle vorlagen. Zusätzlich wurden ein reduzierter Austritt von infektiösen Viruspartikeln und ein verminderter Einbau der S-Proteine in die Virushülle detektiert. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass eine Interaktion des CoV S-Proteins mit zellulärem Tubulin den Zusammenbau und die Freisetzung von Viruspartikeln begünstigt. 

Neben der Virus-Wirts-Interaktion beeinflusst auch das Zusammenspiel der viralen Proteine den Vermehrungszyklus von CoV. Deren Replikation findet im Zytosol der Wirtszelle statt, wobei der Zusammenbau und die Knospung der Viruspartikel am ERGIC erfolgen. Protein-Protein, sowie Protein-RNA Interaktionen sind in diesen Schritten von großer Bedeutung. Das virale S-, M und E-Protein enthalten Signalsequenzen, welche zur Lokalisation im Bereich der Knospung führen. Dadurch erfolgt eine Inkorporation dieser Strukturproteine in neugebildete Viruspartikel. Insbesondere für den Einbau der S-Proteine ist die Interaktion mit dem M-Protein essentiell. S-Proteine bestehen aus einer Ektodomäne, einer Transmembrandomäne, sowie einer zytoplasmatischen Domäne, wobei letztere eine Cystein-reiche und eine ladungsreiche Region besitzt. Zudem weisen einige Vertreter ein Tyrosin-basiertes Motiv innerhalb der ladungsreichen Region auf, welches zur intrazellulären Retention oder Akkumulation führen kann. Es ist bekannt, dass der zytoplasmatische Abschnitt, besonders die ladungsreiche Region des S-Proteins des Maus Hepatitis Virus, sowie des SARS-CoV bei der Interaktion mit M-Proteinen eine essentielle Rolle spielt. In dieser Arbeit wurde die zytoplasmatische Domäne diverser CoV S-Proteine bezüglich des Zusammenspiels mit M-Proteinen untersucht. Die ladungsreiche Region des TGEV S-Proteins wurde dabei durch analoge Sequenzen, von humanen CoV und Fledermaus-CoV S-Proteinen stammend, ersetzt. Hierbei wurden Sequenzen von Vertretern der Gattungen Alpha- und Betacoronavirus gewählt. Abhängig von der Aminosäurensequenz der ladungsreichen Region beziehungsweise dem Vorhandensein von Sortierungssignalen, wie z.B. eines Tyrosin-basierten Signals, wurden in Einzelexpression unterschiedliche Expressionsverhalten für die validierten S-Proteine detektiert. Dennoch war die Interaktion mit dem TGEV M-Protein weder komplett zerstört noch beeinträchtigt. In den Zellen, die S- und M-Proteine co-exprimierten, wurde das S in der Nähe des Zellkerns und der M-Proteine beobachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass ein Aminosäurenaustausch weder im Tyrosin-basierten Motiv, noch innerhalb der ladungsreichen Region von CoV S-Proteinen die Interaktion mit M-Proteinen beeinflusst. Zusätzlich wurden drei TGEV M Y/A Konstrukte, mit mutierten Tyrosinen innerhalb der zytoplasmatischen Domäne, kloniert und für S-M Interaktionsstudien verwendet. Alle getesteten TGEV M Y/A Proteine führten zum Rückhalt des S-Proteins in co-exprimierenden Zellen. Allerdings erschien die S-M Interaktion leicht beeinträchtigt, da im Gegensatz zur Co-Expression von TGEV S und TGEV Mwt weniger S-Protein in der Zelle zurückgehalten wurde.

 

abstract (englisch)

Coronaviruses (CoVs) are enveloped, single-stranded RNA viruses with positive orientation. Their envelope consists of three to four structural proteins, the spike (S) protein, membrane (M) protein, envelope (E) protein, and some members of Betacoronaviruses contain the hemagglutinin esterase protein. Within the virion the nucleocapsid protein is associated with the viral RNA. CoVs infect mammals, including humans, and birds. Several animal-to-human as well as animal-to-animal transmissions are known for CoVs. Since the occurrence of the severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), research has focused on bats which are considered the reservoir species of most CoVs. The entry, replication, and release of transmissible gastroenteritis virus (TGEV), a representative of the genus Alphacoronavirus, in different chiropteran cell lines was examined. Surface expression of the specific receptor, porcine aminopeptidase N, was necessary for TGEV to enter the chiropteran cells. Differences in receptor expression levels as well as differences in viral titers were measured in the analyzed chiropteran cells. Furthermore, a diverse expression pattern of the TGEV S and M protein was observed. We demonstrated that the lack of a specific receptor is responsible for species restriction and is the first hurdle which the virus has to overcome for successful entry and replication. However, infectious titers of released viral particles indicate that additional factors may influence viral replication in chiropteran cells. The differences in distribution of the TGEV S and M protein during infection underline the assumption that host factors depending on bat species and organ source play an important role for a successful CoV infection.

Therefore, cellular components associated with CoV S proteins were investigated. For several viruses microtubules are utilized for the transport of viral components within the host cell. The S protein mediates host-cell-attachment and virus entry. In this study we demonstrated that the last 39 amino acid stretch of the S cytoplasmic domains of TGEV and human CoVs 229E and NL63 interact with tubulin alpha and beta chains. Additionally, a partly co-localization of TGEV S proteins with authentic host cell β-tubulin was observed. Furthermore, drug-induced microtubule depolymerization led to changes in S protein distribution. Here, TGEV S proteins partly co-localized with the ER-Golgi intermediate compartment (ERGIC) and Golgi complex, while these compartments were scattered throughout the cell after nocodazole (NOC) treatment. Moreover, a reduction in the release of infectious virus particles and lower amounts of TGEV S protein incorporated into virions were detected in NOC treated cells. In CoV S transfected or TGEV infected chiropteran cells similar results were obtained. These data demonstrate that interactions of Alphacoronavirus S proteins with tubulin support the virus during assembly and release and that this strategy seems to be a conserved mechanism.

Beside virus-host interactions also the interaction between viral proteins is influencing the CoV life cycle. CoV replication takes place in the host cytosol whereas its assembly and budding occurs at the ERGIC. Protein-protein as well as protein-RNA interactions are important during these steps. The S, M, and E proteins contain signals targeting them to the site of budding where they interact with each other for efficient incorporation. Especially, the incorporation of S proteins is necessary for emergence of infectious progeny, accomplished by S-M interaction. S proteins contain an ectodomain, transmembrane domain as well as a cytoplasmic tail. The cytoplasmic domain consists of a cysteine- and charge-rich region. Some members have a tyrosine-based motif within their S charge-rich region leading to intracellular accumulation. Regarding mouse hepatitis virus and SARS-CoV the S cytoplasmic tail, particularly the charge-rich region, plays a major role during association with M. The corresponding region of different coronavirus S proteins was examined for their impact on S-M interaction. Hereby, the charge-rich region of the TGEV S protein cytoplasmic domain was replaced by human- and bat-derived CoV S charge-rich regions from the genus Alpha- and Betacoronavirus. Different S protein expression pattern due to the charge-rich regions were identified, when expressed alone. Nevertheless, S-M interaction was neither completely abolished nor inhibited. In S and M co-expressing cells S was retained near the nucleus and close to the M protein. Neither amino acid changes within the tyrosine motif of CoV S proteins nor in their charge-rich region influenced S-M interaction. Additionally, three TGEV M Y/A mutants were tested for their ability to retain the S protein. All of them seem to associate with the TGEV S protein visible by S retention, although less S was retained compared to S and Mwt protein co-expressing cells.

 

keywords

Coronavirus, host interaction tubulin

kb

6.148