Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Frank Hermann Roloff

Experimental Strategies for Promoting Neurite Outgrowth of Human Model Neurons

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105896

title (ger.)

Experimentelle Strategien zur Steigerung des Neuritenwachstums von humanen Modellneuronen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/rolofff_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Verletzungen des Nervensystems und speziell des Rückenmarks sind geprägt durch den Verlust der Sensorik und Kontrolle betroffener Extremitäten. Patienten leiden unter den gravierenden Einschränkungen des alltäglichen Lebens und der Notwendigkeit einer permanenten Versorgung. Das Gesundheitssystem ist konfrontiert mit hohen und weiter steigenden Kosten. Derzeitige Therapien betreffen ausschließlich sekundäre Komplikationen, befinden sich noch in der präklinischen Phase oder zeigen keine funktionelle Wiederherstellung.
Verletzungen des Rückenmarks werden in eine akute Phase (eigentliches Trauma) und eine chronische Phase (aus dem Trauma resultierende Schäden) unterschieden. Durch das Trauma kommt es zu verschobenen Wirbeln und damit zu Quetschungen und Scherungen der axonaler Verbindungen. In schwerwiegenden Fällen können Axone vollständig abreißen. Im Verlauf der chronischen Phase kommt es innerhalb von Sekunden nach dem Trauma zu einer zellulären Reaktion des umliegenden Gewebes mit dem Ziel die Läsion des Rückenmarks auf lokaler Ebene einzudämmen und Schäden zu begrenzen. Diesen Prozess bezeichnet man als Gliosis oder Bildung einer glialen Narbe. Die Bildung dieser Narbe führt zu einer mechanischen Barriere und einem regenerationshemmenden Milieu im Rückenmark. Meine Arbeit untersucht drei Eckpfeiler ausbleibender neuronaler Regeneration und zeigt Möglichkeiten zur Steigerung des Neuritenwachstums regenerierender Neurone auf.
Zu Beginn habe ich ein Modellsystem menschlicher Neurone entwickelt, um das Neuritenwachstum messen zu können. Die zeitaufwändige Differenzierung konnte auf drei bis vier Wochen gekürzt werden. Das Ergebnis waren im Vergleich zur klassischen Differenzierungsmethode hohe Zellzahlen von sich entwickelnden Neuronen, während vorher deutlich geringere Zellzahlen von vollständig entwickelten Neuronen gewonnen wurden.
Diese Neurone habe ich dann genutzt, um den Effekt von Ibuprofen und verwandten Pharmazeutika auf das Neuritenwachstum zu untersuchen. Ibuprofen ist dafür bekannt den ubiquitären RhoA/ROCK Signalweg zu hemmen, welcher maßgeblich am Neuritenwachstum beteiligt ist. Inkubation der Neurone mit Ibuprofen führte zu längeren Neuriten und einem verminderten RhoA Gehalt in den Zellen. Hemmung der Rho Kinasen führte zu längeren Neuriten ohne eine Reduktion des RhoA Gehalts. Das Blocken der Rho Kinasen, aber nicht von RhoA selbst, führte zu einer vermehrten Bildung von Primärneuriten.
In einem weiteren Ansatz habe ich die Möglichkeit zur Transplantation von olfaktorischen Hüllzellen ins Rückenmark untersucht. Diese Zellen sollen ein wachstumsförderndes Umfeld für regenerierende Neurone schaffen. Da sich Hüllzellen von Mensch und Nager in vitro stark unterscheiden, habe ich kanine Hüllzellen als Großtiermodell genutzt. In einem scratch wound assay habe ich die Motilität der Hüllzellen aus der Riechschleimhaut und des olfaktorischen Bulbus mit der Motilität peripherer Schwannzellen verglichen. Hüllzellen aus dem Bulbus zeigten eine deutlich höhere Motilität, welche nach Aktivierung des Protein Kinase C Signalwegs noch deutlich gesteigert werden konnte. Schwannzellen und Hüllzellen aus der Riechschleimhaut zeigten insgesamt eine geringere Motilität und keine Änderung nach Aktivierung des Protein Kinase C Signalwegs.
Als nächstes habe ich die kaninen Hüllzellen mit menschlichen Neuronen ko-kultiviert und den Einfluss auf die Herausbildung von Neuriten, sowie auf das Neuritenwachstum selbst untersucht. Hüllzellen aus dem Bulbus zeigten hier einen stärkeren wachstumssteigernden Effekt als Hüllzellen der Schleimhaut oder periphere Schwannzellen.
Der letzte Teil dieser These untersucht Spinnenseide der Gattung Nephila als Trägermaterial für auswachsende Neurone. Ich inkubierte menschliche Neurone auf Spinnenseide, welche um Rahmen aus medizinischem Stahl gewoben war. Die Neurone zeigten bereits nach wenigen Tagen ein Anheften und Auswachsen. Um eine bessere optische Auswertung zu ermöglichen, habe ich die „crossed fiber array“ Technik entwickelt, welche aus gekreuzten Spinnenseidefäden bestand. Diese wurden auf Deckgläschen mittels Gewebekleber fixiert. Bereits nach 24 Stunden zeigten die Neurone den ersten Kontakt mit der Seidenfaser. Die Wachstumskegel umliegender Neurone nahmen Kontakt mit der Seide auf und zogen die Zellsomata in Richtung der Faser. Die Neurone zeigten eine Clusterbildung an und um die Seidenfaser herum, wo hingegen die restliche Fläche des Deckgläschens eine spärliche Verteilung von Neuronen aufwies.
Diese These schafft die Grundlage für ein besseres Verständnis altersbedingter Unterschiede in Neuronen und zeigt Möglichkeiten auf, wie man Schäden des Nervensystems therapieren könnte. Drei verschiedene Ansätze zu Steigerung des Neuritenwachstums wurden hier vorgestellt und untersucht, welche alle vielversprechende Ergebnisse für kommende Therapien aufzeigen.

abstract (englisch)

Injuries to the nervous system and the spinal cord in particular are correlated with an irreversible loss of sensory input and voluntary limb control. Patients suffer from serious restrictions to their life while high costs for the public health systems remain a major challenge. Up to now, therapies that focus on secondary complications, are pre-clinical, or show no functional repair.
Injuries to the spinal cord are differentiated into an acute phase, namely the initial trauma and chronic phase with trauma-related damages. The pathophysiology is characterized by contusions due to dislocated vertebra, shearing and in the worst case scenario complete transection of axons. During the chronic phase, happening within seconds after the initial trauma, glial scar sealing the initial trauma zone is generated. As a consequence, a hostile environment for axonal regeneration containing several growth inhibiting factors is formed. To increase neurite outgrowth after injury, this thesis examines three key aspects for removing the block of regeneration.
First, a primary culture system of human model neurons to measure neurite outgrowth was developed. The rather long neuronal differentiation protocol could be shortened to 4 weeks. Now, high numbers of human neurons in a developing state could be generated in contrast to low cell numbers of neurons in a mature state with the former protocol.
Next, I used these neurons to measure the growth promoting effect of Ibuprofen and related pharmaceuticals known to inhibit a ubiquitous regeneration blocking pathway. Culturing human neurons with elevated Ibuprofen levels increased neurite lengths. A pull-down assay showed that Ibuprofen decreased RhoA levels. ROCK inhibition resulted in longer neurite lengths without decreasing RhoA levels. Moreover, initiation of primary neurites increased after treatment with a ROCK inhibitor, but not for RhoA inhibition.
The second approach used a unique ensheathing cell type to provide a growth permissive environment for ingrowing neurons in the injured spinal cord. Since rodents and primates differ in their in vitro reaction, I used canine cells as a large animal model system. I characterized the motility of ensheathing glial cells originating from the olfactory mucosa or olfactory bulb and compared them with Schwann cells in a scratch wound assay. Ensheathing cells from the bulb showed a higher motility and activation of the protein kinase C pathway showed a strong increase in cell migration. Schwann cells and mucosa ensheathing cells showed a lower motility and did not respond to protein kinase activation. Next I co-cultured canine ensheathing glia with human neurons and examined their ability to support neurite outgrowth and formation. Ensheathing cells from the bulb showed better growth promoting capacities than cells from the mucosa or Schwann cells.
The last part of this thesis evaluated Nephila spp. spider silk as promising biomaterial for transplantation as guiding scaffold to achieve enhanced neurorestoration. I cultured human neurons on silk woven steel frames and showed adhesion and outgrowth within several days. For better optical evaluation, I developed a new crossed fiber array system. Neurons showed initial contact within a few hours cultured on fiber arrays. Growth cones of surrounding neurons get in contact and pulled their cell somata towards the fibers. Neurons showed extensive aggregation on and near spider silk fibers, whereas the surrounding substrate showed a sparse neuronal distribution providing further evidence for Nephila spp. silk as nerve repair scaffold.
This thesis describes maturation related effects in cultured neurons and examines three different in vitro approaches with a view to develop therapies for functional nerve repair after spinal cord injury.

keywords

olfaktorische Hüllzellen, RhoA, Spinnenseide // olfactory ensheathing cells, RhoA, spider silk 

kb

1.107