Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Florian Roggel

 

Ultrasonographische und histologische Untersuchungen von künstlich erzeugten und mit kultivierten mesenchymalen stromalen Zellen aus Fettgewebe (Adipose Tissue Mesenchymal Stromal Cells, AT-MSCs) behandelten Läsionen der oberflächlichen Beugesehne bei Pferden

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103430

title (engl.)

Ultrasonographic imaging and histologic evaluation of surgically created core lesions of the equine superficial digital flexor tendon after treatment with adipose tissue mesenchymal stromal cells (AT-MSCs)

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/roggelf_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von intraläsional applizierten autologen kultivierten mesenchymalen stromalen Zellen aus Fettgewebe (AT-MSCs) auf chirurgisch erzeugte Kernläsionen von oberflächlichen Beugesehnen untersucht. Dabei wurde der Heilungsverlauf über einen Zeitraum von 24 Wochen beobachtet. Im Anschluss an die Euthanasie der Probanden nach 24 Wochen wurden die OBS pathologisch-anatomisch und histologisch untersucht.

Die Untersuchung wurde an 9 jungen Pferden durchgeführt, die klinisch und ultrasonographisch frei von Erkrankungen der Beugesehnen waren. Die Erzeugung der Läsionen erfolgte nach dem Modell von LITTLE u. SCHRAMME (2006) sowie BOSCH et al. (2009) an beiden Vordergliedmaßen. Zeitgleich wurde chirurgisch Fettgewebe aus der paraxialen Glutealregion zur Isolierung der AT-MSCs entnommen und die MSCs unter standardisierten Bedingungen kultiviert. Zwei Wochen nach der Läsionserzeugung wurden 1 x 107 in sterilisiertem autologem Serum suspendierte autologe AT-MSCs randomisiert und verblindet unter ultrasonographischer Kontrolle an jeweils einer Vordergliedmaße eines Pferdes intraläsional injiziert. An der kontralateralen Gliedmaße erfolgte die Injektion von autologem sterilisiertem Serum als Positivkontrolle. Über den Beobachtungszeitraum von 24 Wochen post operationem wurden regelmäßige Verlaufsuntersuchungen mittels klinischer Untersuchungen, B-Mode-Sonographie und mit Hilfe einer neuen sonographischen Untersuchungsmethode, der UTC-Technik, durchgeführt. Durch die Bestimmung der Grauwertstabilität über mehrere angrenzende Querschnittsbilder hinweg wurden vier verschiedene Echotypen unterschieden. Die Echotypen entsprechen perfekt parallel ausgerichteten Faserbündeln (Typ I), nicht exakt parallel ausgerichteten oder nicht durchgängigen Faserbündeln (Typ II), nicht längs ausgerichteten und nicht in Bündeln organisierten Kollagenfibrillen (Typ III) und dem Vorhandensein freier Flüssigkeit und Zellen (Typ IV). Anhand der UTC-Scans wurden die prozentualen Anteile der vier verschiedenen Echotypen innerhalb einer 4 cm langen Interessensregion gemessen. Ab der 4. Woche post operationem wurden die Pferde einem kontrollierten Bewegungsprogramm unterzogen. Im direkten Anschluss an den Untersuchungszeitraum wurden die Pferde euthanasiert, die OBS präpariert und Proben für die histologische Untersuchung entnommen. Nach der Fixierung in Formalin wurden diese in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hämalaun und Eosin gefärbt. Die histologische Untersuchung erfolgte mit Hilfe eines etablierten Scores.

Das verwendete Modell stellte sich als geeignet heraus, um standardisierte OBS-Kernläsionen zu erzeugen, die jedoch in der vorliegenden Untersuchung zeitweise relativ dezent ausgeprägt waren. Auch die Gewinnung des Fettgewebes sowie die Isolierung und Kultivierung der AT-MSCs war in allen Fällen problemlos möglich. Mit Hilfe der gewählten Diagnostika konnten die verschiedenen Phasen der Sehnenheilung nachvollzogen werden.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen erstmalig, dass die Injektion von in autologem inaktiviertem Blutserum suspendierte AT-MSCs 2 Wochen nach chirurgischer Erzeugung der OBS-Läsionen weder zu einer Beschleunigung des Heilungsverlaufs, noch zu einer verbesserten Qualität des gebildeten Ersatzgewebes im Vergleich zur verwendeten Kontrolle (autologes inaktiviertes Blutserum) führt. Die UTC-Untersuchung liefert mögliche Hinweise auf eine geringe, zeitlich begrenzte Beeinflussung der Faserausrichtung und Faserorganisation 8 bzw. 10 Wochen nach der intraläsionalen Applikation der AT-MSCs, die jedoch keinen anhaltenden positiven Effekt auf die Sehnenintegrität über die restliche Rekonvaleszenzperiode zeigte.

 

abstract (englisch)

The aim of this study was to determine the effect of autologous cultured adipose tissue mesenchymal stromal cells (AT-MSCs) on surgically created core lesions of the superficial digital flexor tendon (SDFT). The healing process was monitored over a 24-week period, whereupon the horses were euthanized and all tendons subjected to gross pathologic and histologic examinations.

Nine young horses were used, none of them showed lameness or clinical and ultrasonographic signs of tendon disorders. Superficial digital flexor tendon lesions were created in both forelimbs as previously described by LITTLE and SCHRAMME (2006) and BOSCH et al. (2009). At the same time autologous adipose tissue was harvested from the paraxial gluteal region in order to isolate and cultivate plastic adherent AT-MSCs under standardised conditions.

Two weeks after the induction of lesions, one forelimb of each horse was randomly chosen for intralesional injection of 1 x 107 autologous AT-MSCs suspended in sterilised autologous serum. Injection was performed blinded under ultrasonographic guidance. The same volume of sterilised autologous serum was injected in the contralateral SDFT as positive control. The healing process was monitored at regular intervals by clinical examinations, B-mode ultrasonography, and a novel technique referred to as ultrasonographic tissue characterisation (UTC).

Based on gray level stability over contiguous images, four echo types are distinguished by UTC. Type I echoes are generated at fully aligned tendon bundles, type II echoes are generated at not perfectly aligned tendon bundles, or bundles with incomplete integrity. Type III echoes are generated by accumulations of collagen fibrils not organised in bundles and type IV echoes are generated by free fluid or cells. In UTC scans, the proportions of the four different echo types were calculated respectively within a 4 cm region of interest.

From week 4 onwards, horses were subjected to a controlled increasing exercise programme. After euthanasia 24 weeks post surgery, SDFTs were harvested and evaluated macroscopically. Specimen were fixed in fomalin and embedded in paraffin; longitudinal sections were cut, H&E stained and evaluated using an established score considering five parameters.

The surgical model used in this study was appropriate to create standardised SDFT core lesions, although the lesions were only moderately developed at some scheduled time points. Harvest of adipose tissue, as well as isolation and cultivation of AT-MSCs did not cause complications in any case. Results gathered by the diagnostic modalities chosen could be related to the different phases of tendon healing.

The results of the present study show that intralesional injection of AT-MSCs suspended in inactivated autologous blood serum two weeks after the surgical creation of SDFT lesions neither accelerates tendon healing nor does it lead to improved quality of scar tissue compared to the control substance (sterile autologous blood serum). Ultrasonographic tissue characterisation indicates a potential temporary effect on tendon bundle alignment and bundle organisation 8 and 10 weeks after AT-MSC treatment. However, no long-term beneficial effects on the integrity of tendon tissue were observed during the rest of these 24 weeks.

 

keywords

Tendopathie / MSC / Sonographie, tendinopathy / MSC / ultrasonography

kb

9.086