Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Kristina Rode

Charakterisierung der Blut-Hoden-Schranke während der Entwicklung der Samenkanälchen in skrotalen und retinierten equinen Hoden sowie Etablierung wiederholter Hodenbiopsien für die Erweiterung der andrologischen Diagnostik beim Hengst

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107560

title (engl.)

Characterization of the equine blood-testis barrier during tubular development in normal and cryptorchid stallions and establishment of repeated testicular biopsies for the extended andrological diagnostics in stallions

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/rodek_ws15.pdf

abstract (deutsch)

Die Blut-Hoden-Schranke (BHS) wird im Säugerhoden durch einen Komplex verschiedener Zell-Zell-Verbindungen zwischen benachbarten Sertoli-Zellen gebildet, zu denen u.a. Tight Junctions (TJ), Adherens Junctions (AJ) und Gap Junctions (GJ) gehören. Die Ausbildung dieses sog. Junction-Komplexes während der Pubertät führt zu einer Polarität der Sertoli-Zellen und zu einer Kompartimentierung des Keimepithels in ein basales Kompartiment, das Spermatogonien und primäre Spermatozyten enthält, und ein adluminales Kompartiment, in dem sich die weiter entwickelten Keimzellen befinden. Während die molekulare Zusammensetzung dieser physiologischen Barriere bei vielen Säugerspezies bereits untersucht wurde, ist beim Hengst relativ wenig über den Aufbau der BHS bekannt. Eine funktionelle BHS ist essentielle Voraussetzung für den normalen Ablauf der Spermatogenese und eine Störung der selbigen kann mit einer gestörten Spermatogenese und Sub- oder Infertilität einhergehen. Demzufolge ist die Kenntnis der Zusammensetzung und normalen Entwicklung der BHS die Grundlage für (1) die Beurteilung von Veränderungen dieser Barriere und (2) die Entwicklung geeigneter Therapiestrategien für Fertilitätsstörungen aufgrund einer veränderten BHS.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Expression und Lokalisation der BHS-Proteine Claudin-11 (TJ), ZO-1 (TJ-assoziiert), N-Cadherin (AJ) und Connexin 43 (Cx43, GJ) in Hoden von Hengsten verschiedener Altersstufen mittels Immunhistochemie (IHC) und Western Blot (WB) während der Entwicklung der Samenkanälchen sowie in einseitig retinierten Hoden untersucht. Dazu wurden Hoden von 21 Warmbluthengsten von routinemäßigen, chirurgischen Kastrationen genutzt. Der Junction-Komplex normaler adulter Hoden befindet sich im basolateralen Bereich der Sertoli-Zelle entsprechend der BHS-Lokalisation anderer Spezies; N-Cadherin ist zusätzlich entlang der lateralen und apikalen Membran der Sertoli-Zelle vorhanden. Ein diffuseres Verteilungsmuster der Junction-Proteine im Zytoplasma der Sertoli-Zelle wurde in unreifen Samenkanälchen nachgewiesen. Mit fortschreitender Lumenentwicklung „bewegen sich die BHS-Proteine“ in Richtung der basolateralen Zellmembran. Im immaturen Hengsthoden wurden außerdem apoptotische Keimzellen während der Tubulusentwicklung mittels TUNEL-Assay dargestellt.

Die nicht abgestiegenen Hoden weisen eine abweichende Hodenmorphologie auf. Anzeichen für eine funktionelle Spermatogenese fehlen. Die BHS-Proteine zeigen ein abweichendes Verteilungsmuster, das dem der immaturen Hoden ähnelt.

Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden über den Zeitraum eines Jahres in einem vierwöchigen Intervall Hodenbioptate von vier Warmbluthengsten entnommen und (1) die Auswirkungen wiederholter Hodenbiopsien auf die Allgemein- und Geschlechtsgesundheit der Hengste durch regelmäße klinische, andrologische, histologische, sonographische und IR-thermographische Untersuchungen sowie (2) die Eignung der gewonnen Proben für die Anwendung diagnostischer Methoden der Zell- und Molekularbiologie (Hämatoxylin-Eosin-Färbungen, IHC, WB und PCR) beurteilt.

Es wurden keine signifikanten Veränderungen auf die klinische Gesundheit der Tiere, die Hodengröße, die Libido, den testikulären Blutfluss, die Morphologie des Hodenparenchyms und die Oberflächentemperatur des Skrotums festgestellt. Es konnte zudem genügend Gewebematerial für die Beurteilung der Spermatogenese, den Nachweis bestimmter Proteine in verschiedenen intrazellulären Lokalisationen (Claudin-11 und Cx43 [membranständig], Ki-67 [kernständig] und Vimentin [zytoplasmatisch]) sowie für die Extraktion von mRNA und Proteinen für WB und PCR gewonnen werden.

Die Resultate der vorliegenden Arbeit bestätigen Ergebnisse früherer Studien, die die Entnahme einzelner Hodenbiopsien als relativ sichere und komplikationslose Prozedur darstellten und lassen darüber hinaus die Schlussfolgerung zu, dass die wiederholte Entnahme von Hodenbiopsien ein praktikables Verfahren für die Pferdepraxis mit einem geringen Risiko für den Untersucher und nur minimalen Nebenwirkungen für das Pferd darstellt. Die Bioptate eignen sich für diverse zell- und molekularbiologische Anwendungen zur Identifizierung von Hoden-bedingten Ursachen männlicher Unfruchtbarkeit.

Zukünftig können Verfahren zur Ergänzung bereits etablierter Methoden der assistierten Reproduktion wie z.B. TESE gefolgt von ICSI zur Behandlung sub- oder infertiler Hengste entwickelt werden.

Die von vier Hengsten gewonnenen Gewebeproben wurden zur Darstellung der Proliferation adulter Sertoli-Zellen zu Beginn der Zuchtsaison herangezogen. Die Auswertung immunhistochemisch gefärbter Präparate mit dem Proliferationsmarker Ki-67 und dem Sertoli-Zellmarker Sox9 lieferte noch keine Hinweise auf das Vorhandensein sich teilender Sertoli-Zellen bei adulten Hengsten.

 

Zusammenfassend wurden in der vorliegenden Arbeit durch die Charakterisierung der BHS und die wiederholte Durchführung von Hodenbiopsien beim Hengst zwei Themenkomplexe behandelt, deren Kenntnis wichtige Voraussetzungen für die Beurteilung, Diagnose und Therapie von Hoden-bedingten Fertilitätsstörungen bei Hengsten darstellen. Außerdem wurden die Grundlagen zur Untersuchung saisonaler Veränderungen der Hodenfunktion (z.B. Sertoli-Zellproliferation, Auf‑/Ab‑/Umbau der BHS) sowie zur Darstellung der Hodenentwicklung (durch wiederholte Entnahme von Hodenbiopsien junger Hengste) in ein und demselben Individuum geschaffen.

abstract (englisch)

In mammalian testes, the blood-testis barrier (BTB) is formed between adjacent Sertoli cells by a complex of different junction types including TJ, AJ, and GJ. The formation of this junctional complex during puberty leads to a polarization of the Sertoli cell and to a division of the seminiferous epithelium into a basal compartment containing Sertoli cells, spermatogonia and primary spermatocytes and an adluminal compartment containing more advanced germ cells. In many mammalian species, BTB composition has already been investigated, whereas little is known about the equine BTB. A functional BTB is an essential prerequisite for intact spermatogenesis and its disruption can be associated with impaired spermatogenesis and subsequently with sub- or infertility. Thus, knowledge of the normal development and molecular composition of the BTB is required for (1) assessing aberrations of this barrier and (2) developing adequate therapy strategies of sub- or infertility due to BTB alterations.

Therefore, in the first part of the present study, the expression patterns and localization of the BTB proteins claudin-11 (TJ), ZO-1 (TJ-associated), N-Cadherin (AJ), and Cx43 (GJ) were investigated in 21 warmblood stallions of different ages during testicular development using IHC and WB. Stallions exhibiting unilateral cryptorchidism were also included in this study.

In the normal adult equine testis, the junctional proteins are localized at the basolateral region of the seminiferous epithelium forming a circumferential seal corresponding to the known BTB localization in other mammals; N-Cadherin is additionally expressed along the lateral and apical Sertoli cell surface. In the immature seminiferous cords still lacking a lumen, a diffuse distribution pattern of the junctional proteins (claudin-11, ZO-1, and N-Cadherin) throughout the Sertoli cell cytoplasm was observed. As lumen formation progressed, the immunolocalization shifted gradually towards the basolateral Sertoli cell membranes. Furthermore, apoptotic germ cells were detected in immature stallion testes by use of the TUNEL assay.

The retained testes showed a deviating testicular morphology and no signs of functional spermatogenesis. The BTB proteins also exhibited an altered expression pattern similar to the immature testes.

Adult Sertoli cells are supposed to be postmitotic cells. To date, it is not known if the stallion as a seasonal breeder, similar to e.g. the Djungarian hamster, does exhibit a season-dependent assembly and disassembly of the junctional proteins. However, seasonal differences of the Sertoli cell number have already been reported in adult stallions reflecting seasonal variations of testis function. In order to monitor seasonal alterations of the testicular composition or the BTB within one and the same animal it is necessary to obtain testicular tissue samples without affecting testicular function or even removing the whole organ.

Although several studies have shown that testicular biopsy in the stallion is a relatively safe procedure, it is still not commonly used in equine andrological diagnostics. So far, no data exists regarding repeated testicular biopsies in stallions. Therefore, in the second part of the present study, repeated testicular biopsies were obtained from four stallions at four-week intervals over the period of one year. The objective was the assessment of (1) their effect on the stallions’ health by clinical, morphological, histological, ultrasonographic and infrared thermographic examinations and (2) the utility of the biopsy samples for diagnostic cell and molecular biology purposes including HE-staining, IHC, WB and PCR.

No significant side effects on clinical health, testis size, libido, testicular blood flow, testicular histology, and scrotal surface temperature were observed. The biopsy samples provided sufficient material for assessing spermatogenesis, detecting and localizing protein in different areas of the cell (claudin-11, Cx43 [membranous], Ki-67 [nuclear], vimentin [cytoplasmic]), and for extracting proteins and mRNA for WB analysis and PCR.

Thus, the results of the present study confirm data of previous studies, which present a single testicular biopsy in stallions as a relatively safe procedure. In addition, the results lead to the conclusion that even taking repeated testicular biopsies is a practicable technique for equine practice providing a low risk for the stallion and the examiner.

The biopsy samples are suitable for various diagnostic applications for identifying testicular causes of male equine infertility. Prospectively, therapeutic applications might also be possible to extend the prospects of already established ARTs (e.g. TESE followed by ICSI) in stallions suffering from oligo- or azoospermia.

Preliminary data obtained by immunohistochemical detection of the proliferation marker Ki-67 and the Sertoli cell marker Sox9 in the biopsy samples of four adult warmblood stallions have so far revealed no evidence of proliferating adult Sertoli cells. However, data analyses have not yet been completed and further research has to be performed to explain the seasonal differences in the Sertoli cell number found in literature.

In conclusion, by characterizing the equine BTB and establishing repeated testicular biopsies for the extended andrological examination in stallions, the present study provides important knowledge for the assessment, diagnostics and therapy of testicular causes of fertility disorders in stallions. Furthermore, the present study provides the basis for investigating seasonal differences of equine testis function (e.g. dis-/reassembly of BTB proteins, differences in the Sertoli cell count) within one and the same animal.

keywords

Blut-Hoden-Schranke, Sertoli-Zelle, Hodenbiopsie, blood-testis barrier, Sertoli cell, testicular biopsy

kb

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