Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Svenja Rieke

 

 Untersuchung von Kombinationswirkungen von (Tri)azol-Fungiziden in vitro und in vivo am Beispiel der Nebenniere

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107062

title (engl.)

Combination effects of (tri)azole fungicides in vitro and in vivo on the adrenal gland

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/riekes_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Verbraucher sind über die Nahrung gegenüber Mischungen gering dosierter Pestizidrückstände exponiert. Die derzeit durchgeführte Risikobewertung basiert hingegen auf der toxikologischen Evaluierung der Einzelwirkstoffe. Zwar ist eine kumulative Risikobewertung gesetzlich vorgesehen, aber eine Einigung über die anzuwendende Strategie ist noch nicht erfolgt. Da derzeit innerhalb der EU ca. 300 verschiedene Wirkstoffe zugelassen sind, die in vielen verschiedenen Kombinationen vorkommen können, ist eine toxikologische Evaluation von Wirkstoffkombinationen in vivo analog zu den Einzelwirkstoffen aus technischen sowie aus tierschutzethischen Gründen nicht durchführbar. Effekte von Mischungen können prinzipiell von verschiedenen Konzepten beschrieben werden, wie der Dosis-Additivität oder der Effekt-Additivität. Es können außerdem Wechselwirkungen auftreten, beispielsweise synergistische oder antagonistische Effekte.

Untersucht wurden in dieser Arbeit die Kombinationseffekte der Triazolfungizide Cyproconazol und Epoxiconazol (Kombination I) sowie der Azolfungizide Cyproconazol, Epoxiconazol und Prochloraz (Kombination II) auf die Nebenniere in vivo im Rahmen einer 28-Tages-Fütterungsstudie mit männlichen HanWistar-Ratten sowie in vitro mit adrenalen humanen H295R-Zellen. Gemein sind den Wirkstoffen die CYP51-Inhibierung sowie die unspezifische Inhibierung verschiedener weiterer CYP-Enzyme und die Interaktion mit verschiedenen nukleären Rezeptoren.

Konkret sollten in dieser Arbeit folgende Fragestellungen beantwortet werden:

1)      Lässt sich die erwartete Dosisadditivität in den Kombinationen der Azolfungizide in vivo und in vitro darstellen?

Es zeigte sich, dass im Fall verschiedener Endpunkte in den H295R-Zellen (Cortisolkonzentration im Zellkulturüberstand; Hemmung der FXR-abhängigen Reportergenaktivierung; Induktion der CYP1A1 Genexpression) Dosis-Additivität vorlag. In vivo traten hingegen Wechselwirkungen auf. Hier war die durch Epoxiconazol induzierte Atrophie der Zona fasciculata in den Kombinationen nicht zu beobachten; zudem kam es zu schwächeren Effekten bezüglich des Nebennierengewichtes und der Serumkonzentration von Cholesterol im Vergleich zu der Einzeldosisgruppe Epoxiconazol. Ursächlich sind vermutlich toxikokinetische und toxikodynamische Effekte.

2)      Wie korrelieren klassische und molekulare Parameter?

Die Untersuchung der differenziellen Genexpression erwies sich als wenig geeignet für die Analyse von Kombinationseffekten, konnte jedoch für die Untersuchung des Toxizitätsmechanismus herangezogen werden. Verschiedene differenziell exprimierte Gene wiesen auf eine mögliche verringerte intrazellulären Cholesterolkonzentration in der höchsten Dosisgruppe von Epoxiconazol hin, was eine Ursache für die Atrophie der Zona fasciculata sein könnte. Eine Bestimmung der intrazellulären Cholesterolkonzentration in der Nebenniere war aufgrund des wenig zur Verfügung stehenden Gewebematerials jedoch nicht möglich.

3)      Wie korrelieren in vivo und in vitro Effekte?

Insgesamt zeigte sich, dass in vivo Epoxiconazol, in vitro jedoch Prochloraz die größte toxikologische Potenz aufwiesen. Als wesentliche Gründe für diese Unterschiede können neben einem fehlenden regulierenden systemischen System in vitro die Toxikokinetik sowie der Speziesunterschied herangezogen werden.

4)      Können adverse Effekte anhand von klassischen Parametern oder Effekte auf molekularer Ebene in humanrelevanten Dosierungen nachgewiesen werden?

Niedrigdosiseffekte nahe der humanrelevanten ADI konnten in vivo anhand der klassischen Parameter nicht festgestellt werden. Auftretende Effekte in den molekularen Parametern korrelierten nicht mit den klassischen Parametern, wiesen keine klassische Dosis-Wirkungskurve auf oder konnten anhand unterschiedlicher Methoden (beispielsweise Genexpressionsanalyse + ELISA) nicht bestätigt werden.

 

Im Rahmen dieser Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass eine von der EFSA vorgeschlagene Default-Annahme der Dosisadditivität von Wirkstoffen, die auf das gleiche Organ wirken, hinreichend für den gesundheitlichen Verbraucherschutz erscheint. Zudem konnten keine relevanten Niedrigdosiswirkungen im Bereich des humanrelevanten ADI nachgewiesen werden. Die unterschiedlichen Effekte der Wirkstoffen in dem in vivo und dem in vitro System weisen auf die Bedeutung von Toxikokinetik und Speziesunterschieden hin, die bei einer möglichen Verwendung von in vitro Systemen in der regulatorischen Toxikologie beachtet werden sollten.

abstract (englisch)

Consumers are exposed to different pesticide residue mixtures at low concentrations via the diet. However, the current risk assessment is based on the toxicological evaluation of a single active substance. While the evaluation of active substance mixtures is required in legislative law within the EU, however, a framework for implementation has not been agreed upon. Since there are about 300 authorized substances within the EU, the analysis of pesticide mixtures in routine regulatory toxicity testing, as they are carried out for individual active substances, is not feasible. Possible combination effects of substances are dose additivity (concentration addition), effect additivity (independent action) as well as different interactions (synergism, antagonism).

 

A 28-day feeding study with male HanWistar rats as well as in vitro tests with human adrenal H295R cells were performed with two triazole fungicides (cyproconazole, epoxiconazole) individually and in combination as well as with three azole fungicides (cyproconazole, epoxiconazole, prochloraz) individually and in combination. The substances share the same pesticidal mode of action (CYP51 inhibition) as well as the same toxicological mode of action (nonspecific inhibition of CYP-enzymes and nuclear receptor interactions).

Specifically, the following questions were to be answered:

 

1)                 Is the expected dose additivity of the azole fungicides detectable in in vivo and in vitro experiments?

While dose additivity was determined for different end points in vitro in H295R cells (cortisol for steroid biosynthesis; FXR for receptor interactions; CYP1A1 for gene expression), interactions were visible in the in vivo experiments. Epoxiconazole-dependent atrophy, reduced adrenal weight as well as increased cholesterol serum level were alleviated in both combination experiments. Toxicokinetic and toxicodynamic effects are considered to be the cause.

2)         How do in vivo and in vitro effects correlate?

While epoxiconazole was the most potent toxic substance regarding the adrenal gland in vivo, it had few effects in vitro. Here, prochloraz showed the most pronounced effect. Toxicokinetic effects as well as species differences were regarded as primary causes, besides the absent systemic cellular regulatory system in vitro.

3)         How do classical and molecular parameters correlate?

Gene expression changes were hardly suitable for the analysis of combination effects in the adrenal gland; nevertheless, they could be used for mechanistic studies. They pointed at the reduced intracellular cholesterol level in the highest epoxiconazole treated group in vivo, where, in fact, an atrophy of the zona fasciculata, which depends on cholesterol as a precursor in steroid biosynthesis, was visible. However, due to the low amount of adrenal gland tissue, intracellular Cholesterol concentrations were not measured.

4)      Are effects at human relevant dose levels detectable by classical and

molecular parameters?

The classical parameters gave no hint for toxic low dose effects and, while some molecular effects occurred at low doses, they did not adhere to the classic dose-response model and, when tested, were not visible in complementary testing ( for example: gene expression changes and ELISA).

 

Taken together, the default assumption of dose additivity in the EFSA concept seems to be sufficient to characterize for the combination effect of all three substances. Additionally, no low dose effects at human relevant levels were visible. The correlation analysis between in vitro and in vivo results emphasises the role of adequate ADME tests and species difference knowledge, should these be considered for regulatory purposes.

keywords

Mixture, adrenal, triazole, Kombinationseffekte, Nebenniere, Triazole

kb

5.474