Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Sarinya Rerkyusuke

Investigations on the intra vital diagnoses of

Paratuberculosis in Goats

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106803

title (ger.)

Untersuchungen zur intravitalen Diagnose der Paratuberkulose von Ziegen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/rerkyusukes_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Paratuberkulose (JD) wird durch Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) induziert und verursacht chronische granulomatöse Enteritiden bei Wiederkäuern. Laut OIE Bericht tritt die Erkrankung in 54 Ländern bei Wiederkäuern auf. In Deutschland konnten Seroreagenten gegen MAP in 68% der Herden kleiner Wiederkäuer nachgewiesen werden. Die hier vorgestellten Untersuchungen resultieren aus dem Versuch eine hochgradig mit Paratuberkulose infizierte Milchziegenherde durch Verbesserung des Hygieneprogrammes, des Management, sowie durch Reagentenmerzung und Impfung mit Gudair® zu sanieren. Aufgrund des langsamen Fortschreitens der Erkrankung ist der Infektionsstatus sowie der Krankheitsstatus von Herden und Einzeltieren besonders in frühen Stadien der Erkrankung nur schwer zu diagnostizieren. Das Ziel dieser Studie war es, zwei kommerzielle ELISAs zum Nachweis von Antikörpern gegen MAP bei Milchziegen zu evaluieren, insbesondere auch im Hinblick auf die Gudair® Impfung, auf den Infektionsstatus und auf das humorale Reaktionsmuster (Manuskript I). Weiterhin wurde der zeitliche Verlauf der zellulären und humoralen Immunantwort bei Jungziegen, die unter natürlichen Bedingungen einer Kontamination der Umgebung durch MAP ausgesetzt waren, verfolgt. (Manuskript II).

Im ersten Teil dieser Studie (Manuskript I: "Evaluation of two commercial ELISAs for detection of antibodies against Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in dairy goats.") wurden die Sensitivitäten und Spezifitäten des LE (CATTLETYPE® MAP Ab QIAGEN Leipzig GmbH, Deutscher Platz 5b, D-04103, Leipzig, Deutschland;) und des IE (IDEXX Paratuberkulose Vorführung, IDEXX Laboratories, Inc., Mörike 28/3 D-71636 Ludwigsburg, Deutschland) in 3 Gruppen ermittelt. Gruppe 1 bestand aus 283 Ziegen, die mit Gudair® gegen JD (CZ VETERINARIA AG, Postfach 16, E-36400, Porriño (Pontevedra), Spanien) geimpft waren. Gruppe 2 bestand aus 39 Ziegen mit klinischer JD. Die Infektion mit MAP wurde durch Kultur und PCR bestätigt. Und Gruppe 3 bestand aus 58 mutterlos aufgezogenen ungeimpften Remonten. In Gruppe 1 war die Sensitivität des LE mit 84% versus 36% im IE deutlich höher. Bei den Ziegen mit klinischer JD war die Sensitivität des LEs mit 85% versus 56% im IE ebenfalls erhöht. Die Spezifität der ELISAs wurde in der Gruppe 3 ermittelt, bei der davon ausgegangen wurde, dass alle getesteten Remonten seronegativ waren. Beide ELISA-Tests wiesen eine Spezifität von 100% auf.

Bei der Untersuchung der Antikörperaktivitäten mittels LE bis 3 Jahre nach der Impfung ließen sich drei verschiedene Reaktionsmuster bei der humoralen Immunantwort gegenüber natürlichen MAP-Infektion bzw. gegenüber der Gudair® Impfung differenzieren. 84,3% der Ziegen waren vor der Impfung seronegativ und zeigten nach der Impfung eine Serokonversion, mit lang anhaltenden aber langsam abfallenden Antikörper-Aktivitäten. 11,8% der Ziegen waren vor der Impfung bereits seropositiv und zeigten nach der Impfung in der Regel noch einen deutlichen Anstieg der Antikörperaktivitäten die langsam abfielen. 3,9% der Zeigen waren vor der Impfung seronegativ und reagierten nach der Impfung nicht oder nur mit einer kurzfristigen und geringgradigen Erhöhung der Antikörperaktivität. Einzelne Ziegen mit diesem Reaktionsmuster verendeten an Paratuberkulose. Aufgrund dessen ist eine Sanierung einer Milchziegenherde von der Paratuberkulose allein auf der Basis serologischer Tests offenbar nicht möglich, da einzelne Tiere nicht mit einer humoralen Immunantwort auf eine MAP Infektion reagieren. Drei Jahre nach der Impfung war eine Unterscheidung zwischen MAP infizierten und Gudair®geimpften Ziegen und nicht infizierten geimpften Ziegen anhand der Antikörper-Aktivitäten nicht mehr möglich, unabhängig davon welcher der beiden ELISAs verwendet wurde.

In der zweiten Studie (vgl Manuskript II: "Immune responses in subclinical paratuberculosis of naturally infected young goats") wurden zehn Zicklein in dem o.g. mit Paratuberkulose infizierten Ziegenbestand geboren und blieb die ersten 5 Monate in dieser Herde. Danach wurden sie in der Klinik für einen Monat zusammen mit einer Ziege im Terminalstadium einer klinischen Paratuberkulose untergebracht. Anschließend wurde bei den 10 Kitzen in der Zeit vom 6. bis 17. Lebensmonat die zellvermittelte Immunität (CMI) mittels Gamma-Interferon Test (ID Screen® Wiederkäuer IFN-γ ELISA (ID Vet, ID Vet 167 rue Ben Barka, GAROSUD, F-34070, MONTPELLIER, Frankreich) sowie die humorale Immunantwort (HMI) mittels ELISA-Test (CATTLETYPE® MAP Ab ELISA (QIAGEN Leipzig GmbH, Deutscher Platz 5b, D-04103, Leipzig, Deutschland)) getestet. Darüber hinaus wurden Kotproben mittels RT-PCR-Technik auf MAP-Ausscheidung getestet. Im Alter von 17 Monaten wurden die Jungziegen eingeschläfert und postmortal der Infektionsstatus mittels pathomorphologischer, histologischer und immunhistologischer Methoden sowie kulturell und mittels PCR bzw. mittels RT-PCR untersucht.

Bei drei der zehn Ziegen konnte im Verlauf der Untersuchung eine humorale Immunantwort festgestellt werden. Bei sechs der zehn Ziegen reagierte der Gamma-Interferon-Test ein oder mehrfach positiv. Bei zwei der drei Ziegen mit humoraler Immunantwort wurde die MAP-Infektion postmortal bestätigt und bei fünf der sechs Ziegen mit positivem Gamma-Interferon-Test wurde MAP postmortal im Verdauungstrakt nachgewiesen. Die Untersuchungen bestätigen die Ansicht, dass die zelluläre Immunantwort der humoralen Immunantwort bei der MAP Infektion voraus geht. Allerdings sind die Aktivitäten im Gamma-Interferon-Test wie auch im Antikörper-ELISA starken Schwankungen unterlegen, die nicht nur von der Sensitivität und Spezifität der jeweiligen Tests abhängen, sondern vor allem durch die individuelle Reaktionslage des Einzeltieres abhängig ist. Um den Infektionsstatus eines Einzeltieres intravital feststellen zu können, sind neben der Untersuchung des Ausscheidungsstatus insbesondere in frühen Phasen der Erkrankung wiederholte Untersuchungen der zellulären als auch der humoralen Immunantwort evtl. über längere Zeit notwendig.

abstract (englisch)

Johne’s disease (JD) is caused by Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) and induces chronic granulomatous enteritis in ruminants. OIE reported JD in domestic and wild animals in 54 countries. Moreover, 68% of small ruminant flocks in Germany were MAP sero-positive. This investigation was made in the context of a sanitation program in a goat herd with a high prevalence of MAP infections, with hygiene measures, test and slaughter, and vaccination with Gudair®. Due to the slow progression of the disease the status of infection of a herd or an individual goat is difficult to diagnose, especially in the early stages of the infection. The aim of this study was to evaluate the diagnostic procedure in goats by testing two commercial ELISAs for detecting antibody activities against MAP in dairy goats, especially after Gudair® vaccination, depending on infectious status and immune reaction patterns (cf. manuscript I). Furthermore, the time course of cellular immune response and humoral immune response was followed up with different methods in young goats naturally infected with MAP (manuscript II).

The first part of this study (cf. manuscript I: “Evaluation of two commercial ELISAs for detection of antibodies against Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in dairy goats”) describes the results of the sensitivities, specificities of LE (CATTLETYPE® MAP Ab, QIAGEN Leipzig GmbH, Deutscher Platz 5b, D-04103, Leipzig, Germany;) and IE (IDEXX Paratuberculosis Screening, IDEXX Laboratories, Inc., Mörikestraße 28/3 D-71636 Ludwigsburg, Germany) in 3 groups including 283 goats vaccinated with Gudair® against JD (CZ VETERINARIA S.A., P.O. Box 16, E-36400, Porriño (Pontevedra), Spain), 39 clinical JD goats confirmed by culture and PCR, and 58 motherless reared unvaccinated replacement kids. Especially, vaccinated goats were analyzed three consecutive years after vaccination to follow up the immune reaction patterns and infectious status in a MAP infected dairy goat herd with a high intra herd sero-prevalence. In this investigation, the sensitivity of LE was higher than IE in the vaccinated group (84% vs. 36%; LE vs. IE) and clinical JD group (85% vs. 56%; LE vs. IE). However, the specificity of both ELISA test was 100% in the replacement group. By following the antibody activities against MAP over 3 year after Gudair® vaccination by LE three different reaction patterns were found, including 84.3% uninfected reactors, 11.8% non reactors, and 3.9% infected reactors. These results provide confirmatory evidence that in uninfected reactors antibody activities declined every year after vaccination, with significant difference between 1st and 3rd year after vaccination, also when both ELISAs were tested. Moreover, it was not possible to distinguish the antibody activities between uninfected and infected reactors three years after vaccination. Furthermore, some goats showed no sero-conversion after vaccination and some of these acquired clinical JD, confirmed by culture and PCR, still being sero-negative measured with both ELISAs. This indicates that these animals are not able to react adequately to MAP by humoral antibody production. It can be concluded that both tests can be used as a routine screening for herd tests. For a test and slaughter policy to reduce the prevalence in MAP in infected flocks the ELISA with the highest sensitivity should be used. Due to non reacting goats to MAP infection it is not possible to sanitate a herd by test and slaughter policy based on MAP antibody ELISA alone.

In the second study (cf. manuscript II: “Immune responses in subclinical paratuberculosis of naturally infected young goats”), ten goat kids stayed with their dams until 5 months of age and were then exposed to a goat with clinical JD for one month afterwards. Their immune response was examined monthly from 6th to 17th months by testing cell-mediated immunity (CMI) using an IFN-γ test (ID Screen® Ruminant IFN-γ ELISA (ID Vet, ID Vet 167 rue Mehdi Ben Barka, GAROSUD, F-34070, MONTPELLIER, France) and humoral immunity (HMI) using an antibody ELISA test (CATTLETYPE® MAP Ab ELISA (QIAGEN Leipzig GmbH, Deutscher Platz 5b, D-04103, Leipzig, Germany)). Furthermore, RT-PCR technique was used to detect the shedding of MAP in feces during the period of investigation. At the age of 17 months they were euthanized and necropsied to confirm JD infection by macroscopical and histological findings, immunohistochemistry, bacterial culture combined with PCR, and RT-PCR. Three and six goats developed HMI and CMI responses, respectively. Additionally, in 2 from 3 goats HMI positive and in 5 out of 6 CMI positive goats MAP infections were confirmed by post mortem examinations. HMI reaction tended to be later than CMI reaction. However, the reactions of cellular and humeral immunity were fluctuating and not permanent in the individual goats. This investigation indicates that the immune responses against naturally acquired MAP infection are considerably variable between and also within individual goats. The intra vital diagnoses of MAP infection status of an individual goat depend not only on sensitivity and specificity of the used tests, but on the individual immune response over time. Therefore repeated sampling and tests for CMI and HMI are recommended for accurate diagnosis of MAP infections in young goats.

keywords

Paratuberkulose, Diagnose, Ziegen, Paratuberculosis, diagnoses, goats

kb

503