Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Requardt, Hendrik

Polyethylene Glycol functionalized Multi Walled Carbon Nanotubes

for Nanomedical application as Drug Carriers

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110886

title (ger.)

Polyethylenglykol-funktionalisierte Kohlenstoffnanoröhren für die nanomedizinische Verwendung als Medikamententransporter (Drug Carrier)

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/requardth_ws17.pdf

abstract (deutsch)

Eine schlechte Bioverfügbarkeit, geringe Blutzirkulationszeiten und starke Nebenwirkungen sind nur einige der negativen Eigenschaften, durch die wichtige Arzneimittel, wie Chemotherapeutika, stark in ihrer anwendbaren Dosis limitiert werden. Auf Nanomaterialien basierende Medikamenten-Transporter (engl.: Drug carrier (DCs)) sind dazu in der Lage diese Probleme zu beheben, indem sie Medikamente sicher durch den Körper zum Zielort transportieren. Das Ziel dieser Arbeit war es in vitro zu untersuchen, ob mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren (engl.: multi walled carbon nanotubes (MWCNTs)) als drug carrier eigesetzt werden können, da ihre physikochemischen Eigenschaften Vorteile gegenüber sphärischen DCs vermuten lassen (wie beispielsweise eine erhöhte Ladungskapazität pro einzelnen Transporter).

 

Der experimentelle Teil der Arbeit wurde in zwei Hauptabschnitte unterteilt. Zuerst wurde untersucht, ob die Entfernung von Eisenrückständen aus der MWCNT-Struktur, mit Hilfe einer nachträglichen Hitzebehandlung, zu einer Reduktion der Zytotoxizität der als Grundmaterial für die DCs vorgesehenen MWCNTs führt. Für die Beurteilung wurden sowohl grundlegende Parameter wie die Zellviabilität und Membranintegrität untersucht, wie auch weiterführende Parameter wie die intrazelluläre Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (engl.: reactive oxygen species (ROS)) und eine Zellzyklusanalyse. Die Annahme, dass die Hitzebehandlung eine Verbesserung der MWCNT Zytotoxizität bewirkt, wurde durch die Ergebnisse der Untersuchungen widerlegt. Die nachträgliche Hitzebehandlung induzierte eine signifikante Erhöhung der Zytotoxizität, in Verbindung mit einer erhöhten ROS Produktion und dem Auslösen eines G2-Zellzyklusarrestes (engl.: G2-phase arrest). Weder eine signifikante ROS Produktion, noch der Zellzyklusarrest konnten für die unbehandelten MWCNTs nachgewiesen werden. Eine umfangreiche Charakterisierung der beiden MWCNTs zeigte, dass eine signifikant verringerte Anzahl an Oberflächendefekten der vermeintliche Grund hierfür ist. Die verringerte Anzahl an Oberflächendefekten führt zu einer erhöhten MWCNT-Hydrophobizität und dadurch zu einer Verstärkung der Zytotoxizität.

 

Im zweiten experimentellen Abschnitt wurde ein zweistufiger solvothermaler Prozess entwickelt um die MWCNTs kovalent mit Polyethylen Glykol (PEG), mit drei unterschiedlichen Kettenlängen (2, 12 und 20kDa), zu funktionalisieren. Das Ziel des Prozesses war es Biokompatibilität in einem in vitro Co-Kultur-Modellsystem herzustellen, welches aus primären humanen Nabelschnurendothelzellen (engl.: HUVECs) sowie primären glatten Muskelzellen der Nabelschnur aufgebaut war und eine Arterienwand simulieren sollte. Durch eine Analyse der Zellviabilität und Membranintegrität von exponierten HUVECs wurde festgestellt, dass eine zwölfstündige PEG-Funktionalisierung nicht ausreicht um jegliche Zytotoxizität der MWCNTs zu unterdrücken, eine verlängerte Funktionalisierungszeit auf 24 Stunden zeigte allerdings den gewünschten Effekt. Im weiteren Verlauf wurden die Auswirkungen der 24 Stunden funktionalisierten MWCNTs (MWCNT-PEG) auf HUVECs systematisch untersucht, unter anderem durch den Einsatz von mikroskopischen (Konfokal- und Immunfluoreszenzmikroskopie) und Genexpressionsanalysen. Die Untersuchungsergebnisse zeigten, dass nichtmodifizierte MWCNTs sowohl eine Entzündungs- wie auch eine Überladungsreaktion der Zellen hervorrufen. Außerdem führten sie zu einer deutlichen Veränderung des Zytoskeletts, induzierten Multipolarität in mitotischen Zellen (was zum Zellzyklusarrest führt) und riefen eine signifikante Regulierung von Genen aus Apoptose-, Nekrose-, und Immuntoxikologischen Pathways hervor. Eine vergleichende Analyse zur Pathwayaktivierung zeigte moderate Aktivierungszahlen in unterschiedlichen Krankheits- und negativen Biofunktions-Pathways (z.B. für Krebs, Leukozyten-Infiltration, ROS, cell death, etc.). MWCNT-PEG zeigten hingegen keinerlei Entzündungsreaktion in exponierten HUVECs. Für die MWCNT-PEG mit 12 und 20kDa Kettenlänge wurde bei der Maximaldosis (25 µg/cm²) eine Überladungsreaktion der Zellen festgestellt. Diese entsteht dann, wenn die Kombination aus MWCNT und PEG mit hoher Kettenlänge, bei einer hohen Expositionsdosis auf die Zellen sedimentieren. Die mikroskopischen Analysen zeigten weder eine Veränderung der Zytoskeletts noch eine Induktion von Multipolarität durch die MWCNT-PEG. Die von den MWCNT-PEG ausgelöste Genregulation war gering, nur einige wenige Gene wurden leicht oberhalb des Grenzwertes (RFC > 2) reguliert. Die Analyse zur Pathwayaktivierung zeigte, aufgrund der geringen Anzahl regulierter Gene, keine Aktivierungszahl für die drei unterschiedlichen MWCNT-PEG.

 

In einem letzten Schritt wurde die Ladungskapazität der entwickelten DCs (MWCNT-PEG mit 2, 12 und 20kDa) durch eine hydrophobische Beladung mit Doxorubicin (DOX) untersucht. Alle drei DCs zeigten eine Ladungskapazität von ~200 % (Gewichtsprozent). Im Anschluss wurde die Zytotoxizität von DC-gebundenem DOX mit der von freiem DOX in HUVECs verglichen. Ungebundenes DOX induzierte eine starke, dosisabhängige Zytotoxizität, wodurch die Viabilität von HUVECs, bei einer DOX-Konzentration von 2 µM, auf <20 % reduziert wurde. DC-gebundenes DOX rief einen leichten Vitalitätsverlust hervor (75 % der Kontrolle), dieser war allerdings über den gesamten Dosisbereich (bis 10 µM) konstant.

 

Die Untersuchungsergebnisse führen zu zwei wichtigen Erkenntnissen: (1) Selbst kleine Modifikation oder Behandlungen können die biologischen Eigenschaften (wie Zytotoxizität) von Nanomaterialien signifikant beeinflussen. Im hier vorliegenden Fall führte die reduzierte Anzahl an Oberflächendefekten, durch eine einfache Hitzebehandlung, zu einer signifikanten Verstärkung der negativen, zytotoxischen Effekte. (2) Der hier präsentierte solvothermale Prozess zur PEG-Funktionalisierung führt zu einer soliden in vitro Biokompatibilität der vorgestellten MWCNTs. Somit haben die MWCNT-PEG ein hohes Potential zur Anwendung als Medikamententransporter (drug carrier).

abstract (englisch)

Low bioavailability, poor circulation half-times, and strong adverse effects are only a few negative properties severely dose-limiting the applicability of important drugs like chemotherapeutics. Drug carriers (DCs), based on nanomaterials, can help to overcome this problem by safely transporting the drug molecules to the target area. The aim of this thesis was to test in vitro if multi walled carbon nanotubes (MWCNTs) can be utilized as drug carriers, since their physical dimension promise advantages over spherical carriers, like an improved loading capacity per individual carrier.

 

The experiments were divided into two major parts. At first, it was investigated if the removal of residual iron from the CVD (chemical vapor deposition) synthesized MWCNTs, via a post-production heat-treatment, could reduce the cytotoxicity of MWCNTs, which would act as a base material for the DCs. The analyses included basic readouts, like cell viability and membrane integrity, as well as more complex readouts, like the intracellular production of reactive oxygen species (ROS) and a cell cycle analysis. The assumption that the removal of the residual iron could reduce MWCNT cytotoxicity was refuted by the results. The post-production heat-treatment induced a significant increase in MWCNT cytotoxicity, combined with elevated intracellular ROS production and the induction of a G2-phase arrest (cell cycle arrest). Both, the elevated ROS production and cell cycle arrest were not observed for the untreated MWCNTs. Thorough characterization of the two MWCNT types revealed that the presumable reason for these findings is a significant reduction of surface defects during the heat-treatment. The reduced amount of surface defects intensifies the MWCNT hydrophobicity, leading to an increase of the described adverse effects.

 

In the second experimental part, a two-step solvothermal functionalization process was established to covalently functionalize the MWCNTs with polyethylene glycol (PEG) in three different chain lengths (2, 12, and 20kDa). The aim was to achieve biocompatibility in an in vitro co-culture model of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and human umbilical vein smooth muscle cell (HUVSMC), representing a human blood vessel. Analysis of the cell viability and membrane integrity of the HUVECs revealed, that 12 h of PEGylation was not sufficient to negate all cytotoxicity of the MWCNTs, however increasing the duration to 24 h PEGylation did. The effect of the 24 h PEGylated MWCNTs (MWCNT-PEG) on HUVECs was systematically analyzed, including advanced microscopy-based analyses (confocal and immunofluorescence) and a gene expression analysis. The results illustrated that unmodified MWCNTs induced a significant proinflammatory as well as an overload reaction in HUVECs. Additionally, the MWCNTs severely altered the cellular cytoskeleton, induced multipolarity in mitotic cells (leading to a cell cycle arrest) and significantly regulated genes from apoptotic, necrotic, and immunotoxic pathways. Comparative in-depth pathway activation analysis revealed moderate activation z-scores in several disease and adverse bio function pathways. MWCNT-PEG, on the other hand, did not induce any pro-inflammatory reaction in HUVEC. An overload reaction was detected for the 12 and 20kDa type in the highest dose (25 µg/cm²), which was related to the deposition of a high MWCNT dose, combined with long PEG molecules, onto the cell surface. The microscopical analyses presented no alteration of the cellular cytoskeleton and no induction of multipolarity from MWCNT-PEG. The gene regulation was minor, with only a few genes being regulated slightly above the fold change cutoff (RFC > 2). Pathway activation analysis did not reveal any activation scores for the three types of MWCNT-PEG, given the small amount of regulated genes.

 

In a final step, the drug loading capacity of MWCNT-PEG was investigated by loading Doxorubicin (DOX) onto the drug carriers (DCs), via hydrophobic drug loading. All three DCs presented DOX loading capacities of ~200 % (wt/wt). Subsequently, the cytotoxicity of DC-loaded DOX was compared to free DOX using HUVECs. The free DOX showed a strong, dose-dependent cytotoxicity, reducing HUVEC viability to <20% at 2 µM. DC-loaded DOX induced a slight viability reduction (75% of control), which was consistent over the whole dose-range (up to 10 µM).

 

Overall, two important findings were obtained: (1) Even minor modifications or treatments can significantly influence biological properties (like the cytotoxicity) of nanomaterials. In this case, the reduction of MWCNT surface defects (via heat-treatment) significantly increased adverse effects. (2) The presented PEGylation process leads to a sound in vitro biocompatibility of the presented MWCNTs. Therefore, the MWCNT-PEG possess a high potential in drug carrier application.

keywords

Kohlenstoffnanoröhren, Nanomedizin, Medikamententransporter, Carbon Nanotubes, Nanomedicine, Drug Carrier

kb

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