Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Ulrike Rensch

Molekulare Untersuchungen zur Triclosan-Toleranz bei Isolaten und Mutanten unterschiedlicher Salmonella-Serovare unter Berücksichtigung einer möglichen Kreuzresistenzentstehung gegenüber antimikrobiellen Chemotherapeutika

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105866

title (engl.)

Molecular investigations of triclosan tolerance in isolates and mutants of different Salmonella serovars considering a possible development of cross-resistance to antibiotics

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/renschu_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Das Biozid Triclosan wird vielfältig z. B. als aktiver antimikrobieller Wirkstoff in Desinfektionsmitteln der Lebensmittelindustrie eingesetzt. Ziel der vorliegenden Studie war es, zur Klärung der Frage beizutragen, ob diese breite Anwendung bei aviären Salmonella-Feldisolaten zu einer Toleranzentwicklung gegenüber Triclosan geführt hat. Hierfür wurden erstmalig Daten zum Empfindlichkeitsstatus von 375 Salmonellen, die aus verschiedenen Zeiträumen in Deutschland isoliert worden waren, gegenüber Triclosan und drei weiteren Bioziden generiert. Für die untersuchten Biozide Acriflavin, Benzalkoniumchlorid und Triclosan war keine Toleranzentwicklung im Vergleich der MHK50/90-Werte von Isolaten aus verschiedenen Zeiträumen zu verzeichnen. Für Chlorhexidin wurde eine Erhöhung der MHK50/90-Werte bei den aktuelleren Isolaten ermittelt. Für das Biozid Triclosan wird neben der Entstehung einer Triclosan-Toleranz die gleichzeitige Bildung von low-level Kreuzresistenzen gegenüber antimikrobiellen Chemotherapeutika vermutet. Da keine Triclosan-toleranten Isolate ermittelt wurden, wurden diese in vitro selektiert. Diese über Nacht selektierten Triclosan-toleranten Mutanten verschiedener Serovare wiesen im Vergleich zu den Triclosan-empfindlichen Ausgangsstämmen eine deutliche Abnahme in der Empfindlichkeit gegenüber Triclosan auf. Während in Untersuchungen die Rolle von funktionell aktiven Effluxsystemen in der Entwicklung einer Triclosan-Toleranz nachgewiesen wurde, konnte die Bildung einer Kreuzresistenz gegenüber antimikrobiellen Chemotherapeutika bei den hier untersuchten Isolaten sowohl resistenzphänotypisch als auch genotypisch durch Expressionsanalysen nicht bestätigt werden.

Um den Einfluss von verschiedenen Effluxsystemen auf die Empfindlichkeit und Adaptationsfähigkeit an Triclosan näher spezifizieren zu können, wurden Experimente mit Insertions- und Komplementationsmutanten durchgeführt.

Neben der bekannten Rolle von AcrAB-TolC konnte erstmals auch eine Beteiligung von EmrAB-TolC und AcrEF-TolC am Export von Triclosan festgestellt werden. Obwohl AcrAB-TolC das wichtigste Effluxsystem für den Transport und die Adaptation an Triclosan zu sein scheint, können die Effluxpumpen EmrAB-TolC und AcrEF-TolC eine funktionelle Inaktivität von AcrAB-TolC teilweise kompensieren und könnten im Falle einer Überexpression zur Triclosan-Toleranz beitragen. Während der Einfluss von Efflux in der Entwicklung einer Triclosan-Toleranz nachweisbar war, konnten die hohen MHK-Werte der selektierten Mutanten damit nicht ausschließlich erklärt werden. Die Analyse der Angriffsstelle von Triclosan, dem fabI-Gen, zeigte bei allen Isolaten der acht einbezogenen Serovare eine Mutation am Codon 93, die zu einem Austausch der Aminosäuren Glycin gegen Valin führte. In weiterführenden Experimenten konnte ein deutlicher Einfluss sowohl dieser Mutation als auch der Überexpression des Gens fabI auf die Empfindlichkeit gegenüber Triclosan festgestellt werden. Diese Veränderungen trugen maßgeblich zu den hohen MHK-Werten der Triclosan-toleranten Mutanten bei. Da der Nachweis Triclosan-toleranter Isolate selten und das Vorkommen der Mutation Gly93→Val in vivo bislang nicht beschrieben wurde, wurden Untersuchungen der Mutanten nach Kulturpassagen ohne Selektionsdruck durchgeführt. Sowohl die Mutation in fabI als auch die MHK-Werte der selektierten Mutanten wurden dabei nach den Kulturpassagen bestätigt. Aufgrund dieser Bestätigungen kann eine verminderte bakterielle Fitness eine mögliche Ursache für den seltenen Nachweis Triclosan-toleranter Salmonellen und die bislang in vivo nicht nachgewiesene fabI-Mutation Gly93→Val darstellen. In anschließenden Wachstumsversuchen, die separat für Mutanten (mit Mutation in fabI) und Feldisolate durchgeführt wurden, konnte diese Vermutung bestätigt werden. So wurde eine signifikant verminderte bakterielle Fitness der selektierten Mutanten ermittelt. In direkter Kompetition von Feldisolaten und Triclosan-toleranten Mutanten ließen sich die Mutanten von den nicht mutierten Stämmen anteilsmäßig deutlich verdrängen. Ohne Selektionsdruck durch Triclosan scheint daher ein Rückgang dieser Mutanten in Salmonella-Populationen wahrscheinlich.

Im Falle einer Risikobewertung der Triclosan-Toleranz und der Kreuzresistenz-entstehung gegenüber antimikrobiellen Chemotherapeutika können diese für Salmonellen dargelegten Ergebnisse wichtige neue Aspekte liefern.

abstract (englisch)

The biocide triclosan is widely used as an active ingredient in many product types, e. g. disinfectants used in the food industry. One aim of the present study was to clarify whether this broad use has led to a development of triclosan tolerance in avian Salmonella field isolates. Therefore, the susceptibility of 375 Salmonella strains to triclosan and three other biocides was determined. When comparing MIC50/90 values of Salmonella isolates of different time periods no development of tolerance could be detected for the biocides acriflavine, benzalkonium chloride and triclosan. Only for chlorhexidine was an increase in MIC values obtained and the more recently collected isolates were significantly less susceptible. For the biocide triclosan, an association of triclosan tolerance and efflux mediated low-level cross-resistance to antibiotics raises concerns. As no triclosan tolerant isolates were determined they were selected during the determination of mutant prevention concentrations. The selected triclosan tolerant mutants belonging to eight different serovars exhibited high MIC values compared to their isogenic parent strains. Experiments in the presence and absence of an efflux pump inhibitor revealed the important role of functional active efflux systems in the adaptation to triclosan. The assumed cross-resistance to antimicrobial agents due to overexpressed efflux pumps could not be confirmed by real-time PCR experiments and susceptibility testing. In order to characterise the influence of efflux pumps in the adaptation process, experiments with insertion and complementation mutants were carried out. In addition to the well- known efflux pump AcrAB-TolC which has been described to extrude biocides such as triclosan, the contribution of two other efflux systems to the transport of triclosan was observed. It seems that AcrAB-TolC is still the major efflux system.

Nevertheless, the efflux pumps EmrAB-TolC and AcrEF-TolC are able to partly compensate an inactivity of AcrAB-TolC and thus may have an effect on triclosan tolerance when overexpressed.

The role of functionally active efflux pumps in the development of triclosan tolerance was demonstrated but the high MIC values of triclosan remained unexplained. Therefore, the influence of the target site of triclosan, the gene fabI, was analysed. Sequence alignment revealed a missense mutation at codon 93 in all investigated isolates that resulted in an amino acid exchange (glycine replaces valine). This mutation and the overexpression of fabI were found to play an important role in decreased susceptibility to triclosan.

As the detection of triclosan tolerant Salmonella isolates is rare and the mutation has been described only for in vitro selected Salmonella Typhimurium, further studies investigating the occurrence of the mutation after serial passages of the mutants without selection pressure were performed. High MIC values and the mutation of fabI in the triclosan tolerant mutants were confirmed. Based on these results, it may be assumed that a fitness cost of the mutants is likely to occur and thus might explain the rare occurrence of triclosan tolerant Salmonellae. This presumption was confirmed by separate growth curve experiments of parent and mutant strains. A significant bacterial fitness cost of the mutants was revealed. Growth competition experiments between parent and mutant strains demonstrated a clear decrease in the amount of mutants. It can be assumed that without selection pressure of triclosan a reduction in the number of these mutants is likely to occur in the population of Salmonella isolates.

These results may provide new aspects for a risk assessment of triclosan tolerance and the development of cross-resistance to antibiotics.

keywords

Salmonellen, Biozide, Effluxpumpen; Salmonella, biocides, efflux pumps

kb

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