Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Johanna Maria Rautmann

Epigenetische Modulation boviner Monozyten und

Makrophagen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106795

title (engl.)

Epigenetic modulation of bovine monocytes and macrophages

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/rautmannj_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Die Epigenetik befasst sich mit Modifikationen an der DNA oder den Proteinen des Chromatins, welche die DNA-Sequenz unverändert lassen, sich aber dennoch auf die Expression von Genen auswirken können. Über mögliche Modifikationen, darauf Einfluss nehmende Faktoren und aus ihnen entstehende Wirkungen in humanen und murinen Zellen gibt es zahlreiche Publikationen. Über epigenetische Vorgänge in bovinen Zellen dagegen ist bisher wenig bekannt, insbesondere in Immunzellen wie Monozyten und Makrophagen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausgesuchte epigenetische Marker (H3K9ac, H3K4me3 und H3K27me3) in bovinen Immunzellen bestimmt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass unter den Gesamtleukozyten die Fraktion der Lymphozyten über das niedrigste Niveau aller untersuchten Marker verfügte. Das höchste Niveau der Acetylierung am H3K9 wurde bei Monozyten festgestellt, das höchste Niveau der Trimethylierungen an H3K4 und H3K27 bei Granulozyten.

Während der Differenzierung von Monozyten in Makrophagen wurde ein signifikanter Anstieg der Expression von H3K9ac, H3K4me3 und H3K27me3 festgestellt. Nach induzierter Polarisierung der Makrophagen zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen nicht-polarisierten M0-Makrophagen und den polarisierten M1- und M2-Makrophagen. Letztere zeigten eine signifikant schwächere Expression der untersuchten Marker. Zwischen M1- und M2-Makrophagen zeigte sich, dass M2-Makrophagen gegenüber M1-Makrophagen zudem eine signifikant stärkere Trimethylierung am H3K4 aufwiesen.

Die drei in dieser Arbeit relevanten epigenetischen Marker wurden zu verschiedenen Zeitpunkten im peripartalen Zeitraum, in dem es zu einer erhöhten Infektanfälligkeit kommt, untersucht, um zu bestimmen, ob es in dieser Zeit zu epigenetischen Modifikationen bei den Monozyten oder den daraus generierten Makrophagen kommt. Es zeigte sich, dass die Acetylierung von H3K9 bei Monozyten kurz nach der Geburt einen Höhepunkt erreichte, danach jedoch wieder abfiel. Die Trimethylierung am H3K27 war dagegen vor der Geburt am höchsten, um post partum wieder deutlich niedriger zu sein. In den aus solchen Monozyten generierten Makrophagen fiel die H3K27me3-Expression während des gesamten Untersuchungszeitraums kontinuierlich ab. Neben den Veränderungen über die Zeit wurde zusätzlich untersucht, ob der BCS eines Tieres, der Gesundheitsstatus, das Alter oder der Zeitpunkt einer BVD-Impfung einen Einfluss auf die drei genannten epigenetischen Marker hat. Bei Betrachtung dieser vier Parameter über den peripartalen Zeitraum zu den verschiedenen Untersuchungstagen konnten jedoch keine nennenswerten Einflüsse festgestellt werden.

Verschiedene bekannte epigenetische Modulatoren wurden daraufhin überprüft, ob sie epigenetisch modulierend auf bovine Monozyten wirken. Von den untersuchten Substanzen (TSA, C646, GSK und 2-PCPA) zeigten TSA, C646 und 2-PCPA eine fördernde Wirkung auf die Phagozytoseaktivität der Monozyten. Allerdings führte allein 2-PCPA zu einer nachweisbaren epigenetischen Modulation indem es zu einer Verringerung der Acetylierung am H3K9 führte. Dieses Ergebnis lies vermuten, dass die festgestellten Einflüsse auf die Phagozytoseaktivität nicht mit epigenetischen Modifikationen in Zusammenhang stehen.

Die darüber hinaus geprüften Zytokine IFNg und IL-4 und -13 sowie Glukokortikoide (Dexamethason, Hydrocortison) und LPS wiesen auf die drei untersuchten Marker keine epigenetisch modulierende Wirkung auf. Dass Wirtsfaktoren dennoch epigenetisch wirksam sein können, wurde für das bovine Chemokin CCL5 gezeigt. Makrophagen, die aus Monozyten in Anwesenheit dieses Chemokins differenziert wurden, wiesen gegenüber Kontrollmakrophagen und ähnlich den M2-Makrophagen eine erhöhte Trimethylierung am H3K4 auf.

Da funktionell unterschiedliche Makrophagen aus Monozytensubpopulationen entstehen, wurde geprüft welche Stimuli die Zusammensetzung von Monozyten beeinflussen.

LPS beeinflusste die Entwicklung der Monozytensubpopulationen indem es eine Verringerung des Anteils der cM sowie einen leichten Anstieg des Anteils der intM und einen deutlicheren der ncM bewirkte. Die beiden Kortikosteroide Dexamethason und Hydrocortison hatten eine gegenteilige Wirkung zu LPS. Von den vier untersuchten epigenetischen Modulatoren führten TSA, GSK und 2-PCPA zu einem gesteigerten Anteil der ncM, TSA zusätzlich zu einer Verringerung des Anteils der intM.

Die auf Zellebene untersuchten epigenetischen Marker H3K9ac, H3K4me3 und H3K27me3 wurden jedoch nicht durch entsprechende Substanzen signifikant beeinflusst. Demzufolge scheinen die Wirkungen auf die Monozytensubpopulationen nicht unmittelbar mit epigenetischen Modifikationen der untersuchten Marker auf Zellebene in Zusammenhang zu stehen. Dennoch ist denkbar, dass die Wirkungen auf die Subpopulationen epigenetisch beeinflusst werden. Möglicherweise ist dies durch Untersuchungen auf Genebene festellbar. Ein Zusammenhang mit epigenetischen Modulationen auf Zellebene, jedoch mit anderen Markern als den hier untersuchten, ist ebenfalls nicht ausgeschlossen.

Abschließend kann gesagt werden, dass in der vorliegenden Arbeit deutliche Unterschiede der Expression epigenetischer Marker in verschiedenen Immunzellen dargestellt werden konnten, und gezeigt werden konnte, dass die untersuchten Monozyten und Makrophagen durch gezielte Stimulationen hinsichtlich verschiedener Merkmale beeinflussbar sind. Um eine gezielte Modifikation des epigenetischen Musters im Hinblick auf eine Beeinflussung der Funktion der Zellen zu erreichen und entsprechende Erkenntnisse für eine Verbesserung der Immunabwehr einzusetzen, beispielsweise um eine stärkere Infektionsabwehr im Peripartum zu erreichen, wären jedoch weiterführende Untersuchungen notwendig. Für diesbezügliche Untersuchungen wäre eine Analyse der epigenetischen Marker auf Genebene denkbar, wie auch die Untersuchung weiterer Marker oder auch weiterer epigenetisch modulierend wirkender Substanzen, deren kommerzielle Verfügbarkeit stetig steigt.

abstract (englisch)

Epigenetic studies modifications of DNA or proteins of the chromatin, which do not change the DNA sequence but modify gene expression. There are numerous studies about epigenetic modifications, influencing factors and effects of these modifications in human and murine cells. However, little is known about epigenetics in bovine cells, especially in monocytes and macrophages.

In this study, three epigenetic markers (H3K9ac, H3K4me3 and H3K27me3) were analyzed. Among leukocytes it could be shown that levels of all three markers were lowest in lymphocytes. The highest level of acetylation of H3K9 was found in monocytes whereas the highest level of trimethylation of H3K4 and K3K27 were found in granulocytes. During differentiation from monocytes to macrophages, an increase of all markers was observed. After macrophage polarization, markers in M0-macrophages were significantly higher than in M1- and M2-macrophages. Between M1- and M2-macrophages there was a difference as well. H3K4me3 levels were significantly higher in M2- than in M1-macrophages.

Furthermore, the epigenetic markers H3K9ac, H3K4me3 and H3K27me3 were repeatedly analyzed in the peripartum, a time period characterized by a higher susceptibility to infection. The aim was to determine whether there are any epigenetic modifications in monocytes or in monocyte-derived macrophages during this period. H3K9ac in monocytes peaked shortly postpartal, but then decreased again. However, there was an antepartal H3K27me3 peak with a postpartal decrease. In macrophages generated from these monocytes, H3K27me3 decreased during the whole observation period. In addition to these studies, the influence of BCS, health status, age or the date of a BVD vaccination on the afore mentioned epigenetic markers was examined. The analysis of these four parameters during the peripartal period and on the different days of assessment, however, did not show any significant influence.

The modulatory effect of several stimulants (TSA, C646, GSK und 2-PCPA) on epigenetic markers in monocytes was assessed. Three of the tested stimulants (TSA, C646, 2-PCPA) resulted in an increased phagocytosis of E. coli and/or S. aureus by monocytes. However, only 2-PCPA modulated one of the analyzed epigenetic markers (decreased H3K9ac levels). It can be assumed that the influence on phagocytosis activity is not based on epigenetic modifications.

Additionally, the cytokines IFNg and IL-4 and -13 as well as dexamethasone, hydrocortisone and LPS were analyzed for their epigenetic modulatory effect. None of these substances influenced the measured epigenetic markers.

Macrophages, generated from monocytes in the presence of the chemokine CCL5, displayed increased levels of trimethylation of H3K4 compared to control macrophages. This was similar to M2-macrophages and proved that host factors such as CCL5 can have an epigenetic effect.

Since monocyte subpopulations differentiate into functionally different macrophages, we investigated which stimuli influence the compostion of monocyte subpopulations.

LPS lead to a decrease of classical monocytes (cM), a slight increase of intermediate monocytes (intM) as well as a distinct increase of non-classical monocytes (ncM), whereas dexamethasone and hydrocortisone induced an opposite effect. Three of the four tested epigenetic modulators (TSA, GSK, 2-PCPA) caused an increase of the ncM fraction. TSA also decreased the intM fraction. These changes were not paralleled by changes of H3K9 acetylation or H3K4 and H3K27 trimethylation. Therefore, the effect of known epigenetic modulators on monocyte subpopulations does not appear to be linked to epigenetic modifications on the cellular level. However, it is conceivable that epigenetic effects on monocyte subpopulations are detectable on a genetic level. Also, it cannot be ruled out that epigenetic modulations occurred on others than the investigated locations.

Finally, this study demonstrates that there are distinct differences in the expression of epigenetic markers in different types of immune cells and that different characteristics of monocytes and macrophages may be influenced by specific stimulation. However, in order to achieve a targeted modification of the epigenetic pattern to influence cell functions and to improve immune defense capacities, e.g. during peripartum, further studies will be needed. Therefor, the broader analysis of different epigenetic markers, the investigation of gene specific modifications and the use of increasingly available commercial epigenetic modulators would be conceivable.

keywords

Epigenetik, Rind, Monozyten, epigenetic, cattle moncytes 

kb

2,246